李 迅，王嘉俊，劉鶴南，陳曉隆

在增殖性視網(wǎng)膜病變的發(fā)生、發(fā)展過程中，腎素-血管緊張素系統(tǒng)中主要效應(yīng)介質(zhì)AngⅡ可能與特異性生長(zhǎng)因子(特別是VEGF)相互作用來影響視網(wǎng)膜的發(fā)育和功能，最終共同導(dǎo)致視網(wǎng)膜新生血管形成［1］。因此，抑制AngⅡ可能會(huì)成為預(yù)防和治療視網(wǎng)膜新生血管的臨床方法。本實(shí)驗(yàn)探討RNV發(fā)生發(fā)展過程中，血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑坎地沙坦抑制RNV的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:鼠齡為7 d的健康C57BL/6J清潔級(jí)新生小鼠(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部)40只，體質(zhì)量4.0～5.0 g，性別不限，與哺乳母鼠共同飼養(yǎng)，所有動(dòng)物均具有動(dòng)物檢疫合格證，無任何眼疾。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)條件符合國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。(2)藥品試劑:坎地沙坦、BCA蛋白定量試劑盒(美國(guó)Pierce公司)、ECL發(fā)光試劑盒(美國(guó)Pierce公司)、異硫氰酸葡聚糖熒光素(美國(guó)Sigma公司)、兔抗小鼠AngⅡ多克隆抗體(美國(guó)Sigma公司)、兔抗小鼠VEGF多克隆抗體(美國(guó) Sigma公司)、羊抗兔IgG-HRP(美國(guó)Sigma公司)。

1.2 方法 (1)動(dòng)物分組和模型建立:將40只7 d齡C57BL/6J清潔級(jí)新生小鼠隨機(jī)分為2組:高氧組和坎地沙坦組，每組20只。參照 Smith等［2］的方法建立氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型，高氧組和坎地沙坦組小鼠及哺乳母鼠置于密閉氧箱中，控制氧濃度為(75% ±2%)，5 d(鼠齡12 d)后回到正?？諝猸h(huán)境中。小鼠出氧箱后，坎地沙坦組和高氧組每日分別腹腔注射纈沙坦40 mg/kg和等量生理鹽水，連續(xù)5 d。所有動(dòng)物保持溫度(21±1)℃，光照-黑暗循環(huán)/12 h。熒光素血管灌注視網(wǎng)膜鋪片:兩組鼠齡17 d的小鼠各取3只，將異硫氰酸葡聚糖熒光素溶于1 mL的4%多聚甲醛中，經(jīng)左心室灌注(0.03 mL/g)，摘取眼球，于4%多聚甲醛中固定1 h，游離視網(wǎng)膜，以視盤為中心呈放射狀對(duì)稱切開，用抗熒光衰退封片劑將視網(wǎng)膜封片，采用熒光顯微鏡(日本Olympus公司)觀察視網(wǎng)膜血管形態(tài)的變化。突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核計(jì)數(shù):兩組鼠齡17 d的小鼠各取5只，摘除眼球后，于4%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，平行于角膜至視盤的矢狀位連續(xù)4 μm切片，蘇木素-伊紅染色。每只眼球取10張切片，每組50張，由同一操作者采用隨機(jī)、盲法在光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)下對(duì)切片樣本計(jì)數(shù)每張切片突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)。選取切片時(shí)，注意避開視盤周圍，計(jì)數(shù)血管內(nèi)皮細(xì)胞核時(shí)，僅計(jì)數(shù)與內(nèi)界膜有緊密聯(lián)系的細(xì)胞核，不包括玻璃體腔內(nèi)其他與內(nèi)界膜無聯(lián)系的血管內(nèi)皮細(xì)胞核。Western blot檢測(cè)AngⅡ及VEGF蛋白表達(dá):兩組鼠齡17 d的小鼠各取12只，提取視網(wǎng)膜組織蛋白質(zhì)，用BCA蛋白定量試劑盒定量視網(wǎng)膜組織蛋白質(zhì)含量，每個(gè)樣品上樣含量30 μg，以10%SDS-PAGE 電泳(4 ℃，120 V，2 h)分離蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用4%脫脂奶粉，于4℃下過夜封閉硝酸纖維素濾膜的非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，將濾膜于兔抗小鼠AngⅡ多克隆抗體(1∶400)、兔抗小鼠VEGF多克隆抗體(1∶400)在37℃下孵育2 h，TBS-T緩沖液沖洗濾膜3次后，將濾膜轉(zhuǎn)移至二抗羊抗小鼠 IgG-HRP(1∶1 000)，37℃下孵育1 h，TBS-T緩沖液再次沖洗濾膜后，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。采用 β-actin(1∶400)作為內(nèi)參照。應(yīng)用Quantity One 4.2軟件分析，分別比較各組AngⅡ、VEGF條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值，表示各組蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以±s表示，計(jì)量資料組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，兩變量間相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光素血管灌注視網(wǎng)膜鋪片 高氧組視盤周圍可見大片無灌注區(qū)，視網(wǎng)膜血管不規(guī)則擴(kuò)張，走行迂曲，無灌注區(qū)周圍可見大量新生血管叢，伴明顯熒光滲漏;坎地沙坦組與高氧組比較，血管迂曲和不規(guī)則擴(kuò)張減輕，新生血管叢減少，熒光滲漏減輕。

2.2 突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)高氧組可見較多突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核，有些單獨(dú)出現(xiàn)，有些成簇出現(xiàn);坎地沙坦組與高氧組比較，平均每張切片中突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，見圖1)。

圖1 突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜血管內(nèi)皮細(xì)胞核比較

2.3 視網(wǎng)膜AngⅡ和VEGF蛋白表達(dá)的變化Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，兩組視網(wǎng)膜均有AngⅡ蛋白表達(dá)，AngⅡ蛋白在坎地沙坦組視網(wǎng)膜中表達(dá)較高氧組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，見表1);Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，兩組視網(wǎng)膜中均有VEGF蛋白表達(dá)，VEGF蛋白在坎地沙坦組視網(wǎng)膜中表達(dá)較高氧組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，見表1)。經(jīng)Pearson相關(guān)分析，在氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變中，AngⅡ和VEGF蛋白的表達(dá)呈明顯正相關(guān)(r=0.77，P ＜0.01)。

表1 視網(wǎng)膜AngⅡ和VEGF蛋白相對(duì)含量的比較(±s)

表1 視網(wǎng)膜AngⅡ和VEGF蛋白相對(duì)含量的比較(±s)

灰色標(biāo)度比值高氧組 坎地沙坦組P AngⅡ 0.377±0.005 0.169±0.0040.01 VEGF 0.369±0.004 0.188±0.006

3 討論

本研究利用氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型，目的在于探討坎地沙坦對(duì)RNV的抑制作用。結(jié)果表明，AngⅡ通過上調(diào)VEGF參與增殖性視網(wǎng)膜病變中RNV的形成，早期應(yīng)用坎地沙坦均可一定程度抑制RNV形成。

本文研究顯示，在視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生發(fā)展過程中，AngⅡ和VEGF蛋白水平升高，且兩者呈正相關(guān)。AngⅡ作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)的主要成分和效應(yīng)分子，由血管緊張素I在血管緊張素轉(zhuǎn)換酶和絲氨酸蛋白酶的作用下轉(zhuǎn)化生成，通過AngⅡ受體發(fā)揮作用［3］。事實(shí)上，AngⅡ的絕大多數(shù)生物學(xué)效應(yīng)包括:血壓調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長(zhǎng)、血管生成和生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)等，均通過AngⅡ受體介導(dǎo)，因此，AngⅡ不僅是一種血管活性物質(zhì)，而且還是一種生長(zhǎng)因子，可以促進(jìn)多種血管細(xì)胞的擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移以及合成，從而引起血管生成和重建［3-4］。AngⅡ受體是一種七跨膜結(jié)構(gòu)域G蛋白偶聯(lián)受體，并通過以下3種途徑發(fā)揮作用:①AngⅡ受體和異三聚體G蛋白相互作用，激發(fā)不同的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括磷脂酶C、磷脂酶A2、磷脂酶D、蛋白激酶C和絲裂原活化蛋白激酶的激活。②AngⅡ通過AngⅡ受體激活許多非受體酪氨酸激酶類的磷酸化作用，包括磷脂酶cγ、Src家族蛋白激酶、Janus激酶、粘著斑激酶、富脯氨酸蛋白酪氨酸激酶。③AngⅡ?qū)δ承├野彼峒っ甘荏w也具有反式激活［5］。VEGF是一種有效的促血管生成的活性因子，在增殖性視網(wǎng)膜病變中，VEGF表達(dá)上調(diào)并參與血-視網(wǎng)膜屏障的破壞［6］。在視網(wǎng)膜周細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中，AngⅡ通過血管緊張素Ⅱ受體介導(dǎo)VEGF表達(dá)，刺激VEGF產(chǎn)生，影響視網(wǎng)膜微血管系統(tǒng)的發(fā)育［7］?？驳厣程雇ㄟ^選擇性阻斷血管緊張素Ⅱ受體和AngⅡ結(jié)合發(fā)揮拮抗作用。

本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，坎地沙坦減少AngⅡ生成，從而抑制VEGF，短期內(nèi)對(duì)以RNV為特征的增殖性視網(wǎng)膜病變的防治和轉(zhuǎn)歸有重要意義。但長(zhǎng)期療效還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)和臨床研究來證實(shí)。

［1］ 劉鶴南，朱穎，陳曉隆，等.腎素-血管緊張素系統(tǒng)阻滯劑預(yù)防早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變研究［J］.中華眼底病雜志，2010，28(3):291-293.

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