趙成廣，鄧天麟，吳玉斌*

腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)是腎間質(zhì)纖維化的重要環(huán)節(jié)。腎間質(zhì)纖維化時(shí)，約36%的成纖維細(xì)胞來(lái)源于腎小管局部EMT［1］。轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞以失去上皮細(xì)胞的標(biāo)志物CK-18和出現(xiàn)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA為標(biāo)志。EMT過(guò)程涉及腎小管基底膜的破壞及細(xì)胞增殖［2-3］，金屬蛋白酶 9(MMP9)降解腎小管基底膜的Ⅳ型膠原，有利于轉(zhuǎn)分化后的腎小管上皮細(xì)胞遷移到腎間質(zhì)，通過(guò)增殖，加劇腎纖維化。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate，EGCG)具有抗肝纖維化的作用［4-6］，EGCG是否對(duì)腎臟腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化有抑制作用尚無(wú)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用EGCG干預(yù)TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞株NRK細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)CK-18、α-SMA及細(xì)胞中MMP9、細(xì)胞周期素(Cyclin)D1的表達(dá)改變，探討EGCG對(duì)NRK細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞:大鼠腎小管上皮細(xì)胞株(NRK-52E)，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。L-EGCG購(gòu)于 Sigma公司。TGF-β1購(gòu)于 Peprotech 公司。α-SMA、CK-18、MMP9、Cyclin D1兔抗大鼠IgG(一抗)購(gòu)于Santa Cruz公司。PrimeScriptTMRT Reagent Kit、Real time quantitive PCR(SYBRRPremix Ex TaqTM)試劑盒購(gòu)于大連寶生物工程有限公司)。PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法 腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)與分組:NRK-52E大鼠腎小管上皮細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)，經(jīng)無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基同步化作用24 h，之后將培養(yǎng)的細(xì)胞隨機(jī)分為4組:1組:正常對(duì)照組(N)，以DMEM培養(yǎng)液為空白對(duì)照。2組:TGF-β1誘導(dǎo)組(培養(yǎng)液中TGF-β1的濃度為10 ng/mL)。3組:EGCG 200 μg/L 干預(yù)組，培養(yǎng)液中 TGF-β1的濃度為10 ng/mL，EGCG 濃度為 200 μg/L。4組:EGCG 400 μg/L 干預(yù)組，培養(yǎng)液中 TGF-β1的濃度為10 ng/mL，EGCG濃度為400 μg/L。各細(xì)胞組在作用48 h后收集細(xì)胞待測(cè)。

1.3 細(xì)胞爬片免疫組化測(cè)定 取1、2、3組同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞爬片，48 h后先PBS洗滌，再4%多聚甲醛固定，置于-20℃冰箱保存待測(cè)。采用免疫組化檢測(cè)α-SMA和CK-18，每組圖片取8個(gè)視野，采取日本OLYMPUS攝像系統(tǒng)和日本MetaMorph/BX41圖像數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)測(cè)定平均光密度值。平均光密度值越大，代表樣本中目的蛋白含量越多。

1.4 細(xì)胞Western-blot分析 提取胞漿蛋白，按照Western-blot標(biāo)準(zhǔn)過(guò)程操作，檢測(cè)指標(biāo)為Cyclin D1，MMP9蛋白。采用Flour Chem V 2.0凝膠成像分析軟件(America)進(jìn)行吸光度掃描分析，結(jié)果以同一張膜上的β-actin作為內(nèi)參，以目的蛋白與內(nèi)參的吸光度比值代表目的蛋白含量的多少，比值越大，說(shuō)明目的蛋白越多。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)Cyclin D1、MMP9mRNA的相對(duì)表達(dá)量 采用SYBR Green I熒光染料嵌合法，分別制作目的基因和管家基因(GAPDH)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的目的基因和管家基因分別進(jìn)行定量。通過(guò)管家基因的校正，檢測(cè)各組目的基因的相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，熒光定量PCR儀自動(dòng)分析并計(jì)算結(jié)果，目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量=目的基因拷貝數(shù)/GAPDH基因拷貝數(shù)，此數(shù)值越大表明樣本中目的基因含量越多。

引物序列:

Cyclin D1-F 5'-AACCACAAAGACGGAGATG-3'Cyclin D1-R 5'-CGGCGGCAAGAATG-3'MMP9-F 5'-ACCCTGCGTATTTCCATT-3'MMP9-R 5'-GCACCAGCGATAACCAT-3'GAPDH-F 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'GAPDH-R 5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3'

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析，進(jìn)行正態(tài)分布及方差齊性檢驗(yàn)，各組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NRK細(xì)胞CK-18、α-SMA蛋白表達(dá)的變化

正常對(duì)照組NRK細(xì)胞中CK-18高表達(dá)，α-SMA無(wú)表達(dá);NRK細(xì)胞被TGF-β1誘導(dǎo)48 h后，胞漿中CK-18蛋白表達(dá)明顯減少，α-SMA蛋白出現(xiàn)了高表達(dá);而NRK細(xì)胞被TGF-β1和EGCG聯(lián)合作用48 h后，胞漿中 CK-18蛋白表達(dá)減少不明顯，α-SMA蛋白表達(dá)較 TGF-β1誘導(dǎo)組少。見表 1，圖1～圖6。

表1 EGCG干預(yù)前后CK-18及α-SMA表達(dá)(平均積分光密度值)的變化(n=8，±s)

表1 EGCG干預(yù)前后CK-18及α-SMA表達(dá)(平均積分光密度值)的變化(n=8，±s)

注:*與對(duì)照組比較，P＜0.05;#與TGF-β1組比較，P＜0.05

組別 CK-18 α-SMA對(duì)照組0.671±0.024 0 TGF-β1誘導(dǎo)組 0.225±0.056* 0.857±0.045 EGCG干預(yù)組(200 μg/L) 0.531±0.078# 0.342±0.028*

圖1 對(duì)照組腎小管上皮細(xì)胞(NRK)CK-18表達(dá)情況(免疫組化，×400)

圖2 TGF-β110 ng/mL作用NRK細(xì)胞48 h后CK-18表達(dá)明顯減少(免疫組化，×400)

圖3 EGCG 200 μg/L+TGF-β110 ng/mL作用NRK細(xì)胞48 h后，CK-18表達(dá)無(wú)明顯減少(免疫組化，×400)

圖4 對(duì)照組NRK細(xì)胞基本無(wú)α-SMA蛋白(免疫組化，×400)

圖5 TGF-β110 ng/mL作用NRK細(xì)胞48 h后α-SMA蛋白出現(xiàn)高表達(dá)(免疫組化，×400)

圖6 EGCG 200 μg/L+TGF-β110 ng/mL作用NRK細(xì)胞48 h后α-SMA蛋白表達(dá)減少(免疫組化，×400)

2.2 NRK細(xì)胞Cyclin D1、MMP9蛋白及其mRNA表達(dá)變化 NRK細(xì)胞被TGF-β1誘導(dǎo)48h后，Cyclin D1、MMP9蛋白及其mRNA表達(dá)明顯升高;而NRK細(xì)胞經(jīng)TGF-β1和EGCG聯(lián)合作用后，上述各指標(biāo)較TGF-β1誘導(dǎo)組表達(dá)減少，并且EGCG濃度為400 μg/L時(shí)，比200 μg/L能進(jìn)一步減輕上述蛋白及mRNA的表達(dá)。見表2、表3，圖7、圖8。

表2 EGCG干預(yù)前后Cyclin D1蛋白及其mRNA表達(dá)的變化(n=8，±s)

表2 EGCG干預(yù)前后Cyclin D1蛋白及其mRNA表達(dá)的變化(n=8，±s)

注:*與對(duì)照組比較，P＜0.05;#與TGF-β1組比較，P＜0.05

組別 Cyclin D1/actin Cyclin D1 mRNA/GADPH對(duì)照組0.19±0.02 0.034±0.005 TGF-β1誘導(dǎo)組 0.72±0.05* 0.110±0.009*EGCG干預(yù)組(200μg/L) 0.48±0.04# 0.068±0.005#EGCG干預(yù)組(400μg/L) 0.31±0.03# 0.045±0.003#

表3 EGCG干預(yù)前后MMP9蛋白及其mRNA表達(dá)的變化(n=8，±s)

表3 EGCG干預(yù)前后MMP9蛋白及其mRNA表達(dá)的變化(n=8，±s)

注:*與對(duì)照組比較，P＜0.05;#與TGF-β1組比較，P＜0.05

組別 MMP9/actin MMP9 mRNA/GADPH對(duì)照組0.45±0.05 0.002 5±0.000 3 TGF-β1誘導(dǎo)組 1.11±0.04* 0.007 3±0.000 6*EGCG干預(yù)組(200μg/L) 0.94±0.03# 0.005 5±0.000 3#EGCG干預(yù)組(400μg/L) 0.78±0.02# 0.003 7±0.000 5#

3 討論

TGF-β1是一種公認(rèn)的促纖維化因子［7］，可刺激上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化［8-9］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TGF-β1誘導(dǎo)后的NRK細(xì)胞出現(xiàn)了α-SMA的表達(dá)，而CK-18表達(dá)減少，說(shuō)明NRK細(xì)胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)分化;而EGCG干預(yù)后上述變化減輕，說(shuō)明EGCG能夠維持NRK細(xì)胞的上皮表型，減輕轉(zhuǎn)分化。

圖7 NRK細(xì)胞胞漿中Cyclin D1蛋白表達(dá)情況注:TGF-β1誘導(dǎo)組較對(duì)照組表達(dá)增加，EGCG干預(yù)組較誘導(dǎo)組表達(dá)減少，并且EGCG 400 μg/L組較200 μg/L減少更明顯(Western-blot)

圖8 NRK細(xì)胞胞漿中MMP9蛋白表達(dá)情況注:TGF-β1誘導(dǎo)組較對(duì)照組表達(dá)增加，EGCG干預(yù)組較誘導(dǎo)組表達(dá)減少，并且EGCG 400 μg/L組較200 μg/L減少更明顯(Western-blot)

上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌纖維細(xì)胞后，具有十分活躍的增殖和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的功能，通過(guò)增殖，肌纖維細(xì)胞數(shù)量增多，加劇了腎間質(zhì)纖維化的過(guò)程［3］。細(xì)胞增殖通過(guò)細(xì)胞周期來(lái)實(shí)現(xiàn)，而細(xì)胞周期的運(yùn)行則由Cyclin的周期性波動(dòng)來(lái)調(diào)控。Cyclin D1是細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要構(gòu)成之一，其蛋白量的多少關(guān)系著細(xì)胞能否通過(guò)G1/S期的檢查點(diǎn)。Cyclin D1表達(dá)減少可使整個(gè)細(xì)胞周期停滯于G1期，而過(guò)表達(dá)可縮短G1期［10］，高表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞通過(guò)G0/G1期，在細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中，EGCG能減少Cyclin D1的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期的G1/S期阻滯，從而發(fā)揮抗增殖作用［11-12］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TGF-β1誘導(dǎo)的NRK細(xì)胞Cyclin D1蛋白及其mRNA表達(dá)明顯升高。Cyclin D1升高可促進(jìn)轉(zhuǎn)分化后的細(xì)胞增殖，增加了肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量，從而加重纖維化。給予 EGCG和TGF-β1聯(lián)合作用后，Cyclin D1蛋白及其mRNA表達(dá)明顯減少，提示EGCG能抑制轉(zhuǎn)分化細(xì)胞的增殖，從而減輕轉(zhuǎn)分化及纖維化。PCR結(jié)果說(shuō)明，EGCG能從轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)Cyclin D1蛋白的表達(dá)。EGCG 濃度為400 μg/L時(shí)，比200 μg/L能進(jìn)一步減輕Cyclin D1蛋白及mRNA的表達(dá)，說(shuō)明EGCG能以劑量依賴方式抑制Cyclin D1蛋白及其mRNA表達(dá)。

腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT過(guò)程中的關(guān)鍵步驟是腎小管基底膜的破壞，為轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞遷移至腎間質(zhì)提供基本條件［2］，腎小管基底膜主要成分為Ⅳ型膠原，MMP9和MMP2是其降解酶。Ⅳ型膠原維持腎小管上皮細(xì)胞的表型，而間質(zhì)中的Ⅰ型膠原促進(jìn)了EMT的發(fā)生［13］?？梢娀啄さ膿p傷破壞是啟動(dòng)EMT不可缺少的環(huán)節(jié)。在多種腎間質(zhì)纖維化模型中，MMPS/TIMPS比例失衡參與了腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展［14-15］;而在多種腫瘤細(xì)胞中，EGCG能減少M(fèi)MP9的表達(dá)，而減輕腫瘤細(xì)胞的侵襲性［16-18］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TGF-β1誘導(dǎo) NRK 細(xì)胞后，MMP9蛋白及其mRNA發(fā)生上調(diào)，提示TGF-β1通過(guò)上調(diào) MMP9的表達(dá)，降解基底膜，促進(jìn)EMT的發(fā)生。在給予EGCG保護(hù)后，MMP9蛋白及其 mRNA發(fā)生下調(diào)，提示EGCG能通過(guò)抑制MMP9的表達(dá)而保護(hù)基底膜的完整性，起到減輕轉(zhuǎn)分化和纖維化的作用。EGCG濃度為400 μg/L時(shí)比200 μg/L能進(jìn)一步減輕MMP9蛋白及mRNA的表達(dá)，說(shuō)明 EGCG能以劑量依賴方式［19］抑制MMP9蛋白及mRNA的表達(dá)。

EGCG抑制MMP9、Cyclin D1蛋白及mRNA表達(dá)的機(jī)制尚不明確，可能與細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS有關(guān)。近年研究表明，ROS參與了細(xì)胞膜受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［20］。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，雖然不同的生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子引發(fā)各自的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞反應(yīng)，但其作用幾乎均通過(guò)ROS這條共同通路來(lái)完成，因此，這些因子可引起細(xì)胞內(nèi)ROS迅速升高;如果抑制ROS生成，則阻斷了外界刺激引起的相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞增殖等功能受到抑制［21］，EGCG結(jié)構(gòu)中富含酚羥基，容易被氧化成醌類而提供H+，因此，具有顯著的抗氧化活性和清除自由基的能力。張海燕［22］發(fā)現(xiàn)，ROS介導(dǎo)了 TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠NRK細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及細(xì)胞外基質(zhì)聚集，推測(cè)EGCG可能通過(guò)抑制氧化還原信號(hào)傳導(dǎo)，從而下調(diào)Cyclin D1及MMP9的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖和保護(hù)基底膜而減輕NRK轉(zhuǎn)分化的作用，這為臨床防治腎臟纖維化提供理論依據(jù)。

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