楊 濱，婁曉明，吳春麗，李婉萍

銀杏(Ginkgo biloba L.)是木本孑遺植物，其葉、果和外種皮皆可入藥。銀杏外種皮是銀杏種子的外皮層，包含有大量的銀杏多糖、銀杏內(nèi)酯、黃酮及被稱作銀杏酚、酸的化合物等多種物質(zhì)。有報道表明，銀杏外種皮多糖(Ginkgo biloba exocarp polysaccharides，GBEP)對胃癌、肺癌及肝癌細(xì)胞的生長具有一定的抑制效果［1-3］，但其在宮頸癌方面的研究較少。本文研究體外銀杏外種皮對人宮頸癌細(xì)胞增殖及遷移的影響，探討其對宮頸癌的治療作用。

1 實驗材料

1.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)方法 細(xì)胞株:Siha細(xì)胞株購自中科院，由本實驗室傳代保存。細(xì)胞培養(yǎng):用含有10%小牛血清的高糖RPMI1640培養(yǎng)基，37℃飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長，每2～3天傳代1次。

1.2 實驗儀器及試劑 酶標(biāo)儀(BIOTEKElx800);AE30/31倒置相差顯微鏡(麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司);HF90 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司)。細(xì)胞培養(yǎng)用試劑購自Hyclone公司，RNA prep pure動物組織總RNA提取試劑盒，TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒，2×Taq Real Master Mix(SYBR Green)購自天根生物科技(北京)有限公司，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，抗體購自Abcam公司，噻唑藍(lán)(MTT)購自Sigma公司，ELISA檢測試劑盒購自RB公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

2 實驗方法

2.1 銀杏外種皮粗多糖的制備 稱取適量銀杏外種皮，置于圓底燒瓶中，按料液比1∶10、沸水浸提1 h，在熱水浴中回流浸提3次，冷卻后過濾，合并上清液。上清液經(jīng)減壓濃縮，三氯乙酸脫蛋白，離心，調(diào)pH至中性，加入一定體積的95%乙醇，使終濃度為80%。充分?jǐn)噭?，靜置沉淀，所得沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌，真空干燥即可得粗多糖。經(jīng)計算，得到外種皮原料中多糖含量為6.684 g/100 g。

2.2 MTT法檢測GBEP對Siha細(xì)胞的增殖影響

將GBEP用PBS溶出，調(diào)pH至中性，過濾除菌，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?，GBEP稀釋為 10、20、40、80、160、320 μg/mL 濃度梯度。取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×104個/mL，將細(xì)胞以每孔200 μL接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)12 h，使其充分貼壁，然后換為無血清的RPMI-1640培養(yǎng)，加入含GBEP的無血清RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。對照組為不含GBEP的RPMI-1640 培養(yǎng)基，5%CO2，37 ℃ 中孵育 24、48、72 h。每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，繼續(xù)放入CO2培養(yǎng)箱中染色4 h，吸去上清，加入200 μL DMSO溶解細(xì)胞內(nèi)形成的結(jié)晶，用酶標(biāo)儀測定490 nm處吸光度(OD)值，計算GBEP對Siha細(xì)胞生長的抑制率。抑制率(%)=(空白孔OD值－實驗孔OD值)/空白孔OD值×100%，同時計算IC50值，并確定合適的3個實驗計量和實驗時間，用于后續(xù)實驗。

2.3 檢測GBEP對Siha細(xì)胞的侵襲抑制作用應(yīng)用鋪有Matrigel的Transwell小室法測定GBEP對Siha細(xì)胞遷移情況的影響，將鋪膠后的Transwell小室放入24孔板中，下室加入含10%FBS的 RPMI-1640培養(yǎng)液 500 μL;在上室加入含GBEP 終濃度為 0、10、20、40、80、160、320 μg/mL的100 μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)為1×105個/孔。常規(guī)培養(yǎng)24、48、72 h，取出 Transwell小室，PBS 輕輕沖洗，擦去微孔膜上層的細(xì)胞，甲醛室溫下固定15 min，蘇木素染液染色，倒置顯微鏡下(×400)對遷移至微孔膜下層的細(xì)胞計數(shù)。每個樣本選取5個視野計數(shù)細(xì)胞，取其均數(shù)。遷移率(%)=實驗孔細(xì)胞數(shù)/空白孔細(xì)胞數(shù)×100%。

2.4 Siha細(xì)胞中人基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)基因Real Time PCR檢測 經(jīng)MTT實驗確定的實驗條件，取不同濃度(0～320 μg/mL)GBEP處理下對數(shù)生長期的Siha細(xì)胞，加入裂解液收集，提取RNA，并測得濃度，逆轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行Real Time PCR檢測，以GAPDH作為內(nèi)參，進(jìn)行相對表達(dá)量分析。MMP2基因引物為:Forward primer:TGGTTTTCCTCCATCCAGTGG，Reverseprimer:CAGGTTGTCTGAAGTCACTGC。

2.5 GBFP對Siha細(xì)胞MMP-2蛋白分泌表達(dá)的影響 經(jīng)MTT實驗確定的實驗條件，收集不同濃度GBEP處理下的 Siha細(xì)胞培養(yǎng)液上清，4 000 rpm離心10 min，取上清，用MMP-2 ELISA測定試劑盒檢測腫瘤細(xì)胞上清中MMP-2含量。

2.6 統(tǒng)計方法 實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，各指標(biāo)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 MTT法檢測GBEP對Siha細(xì)胞增殖的影響

MTT檢測正常Siha細(xì)胞與GBEP處理后的Siha細(xì)胞在處理后24、48、72 h后的增殖情況，并繪制生長曲線，見表1、圖1。結(jié)果顯示，GBEP處理后的細(xì)胞較正常培養(yǎng)的Siha細(xì)胞增殖速度明顯減緩，經(jīng)計算，得到 24 h、48 h、72 h的 IC50值分別為78.09、58.25 和48.63 μg/mL，48 h 為適合實驗。

表1 不同濃度及時間GBEP對Siha細(xì)胞增殖的抑制情況

圖1 GBEP對Siha細(xì)胞的增殖抑制曲線

3.2 GBEP對Siha細(xì)胞侵襲的影響 利用Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室測定GBEP處理后細(xì)胞遷移能力的變化，見圖2。結(jié)果顯示，GBEP處理后，Siha細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)明顯低于正常培養(yǎng)細(xì)胞(P＜0.05);隨著GBEP濃度的增加，細(xì)胞遷移率逐漸降低，隨著藥物處理時間的增加，細(xì)胞遷移率降低。

圖2 GBEP對Siha細(xì)胞遷移的影響

3.3 Real Time PCR檢測Siha細(xì)胞中MMP-2基因表達(dá)情況 應(yīng)用Real Time PCR方法檢測未經(jīng)處理Siha細(xì)胞和GBFP處理后的細(xì)胞中MMP-2基因的表達(dá)情況，結(jié)果如圖3所示，隨著GBFP濃度的增加，Siha細(xì)胞中MMP-2基因的表達(dá)量降低，濃度為40 μg/mL時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，80 μg/mL以上時，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

圖3 不同濃度GBEP對siha細(xì)胞中MMP-2基因表達(dá)的影響

3.4 GBEP對Siha細(xì)胞上清中MMP-2分泌表達(dá)的影響 見圖4。結(jié)果顯示，GBFP可明顯降低Siha細(xì)胞上清中MMP-2的分泌表達(dá)，80 μg/mL以上GBFP處理組與對照組相比，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

圖4 不同濃度GBEP對siha細(xì)胞MMP-2分泌表達(dá)的影響

4 討論

多糖作為一種重要的生物活性成分，不是一種單一的化學(xué)物質(zhì)，而是聚合程度不同的多種糖物質(zhì)的混合物［4］。多糖具有提高免疫、抑制腫瘤等多方面功能，在植物、動物、微生物中廣泛存在，近年來多糖成為天然藥物的一個研究熱點。銀杏外種皮多糖(Ginkgo biloba exocarp polysaccharides，GBEP)是從銀杏的外種皮中提得的活性多糖物質(zhì)［5］。由于銀杏外種皮是銀杏加工過程產(chǎn)生的廢棄物，不僅污染環(huán)境，也造成資源浪費，而從其中提取多糖，原料成本低，變廢為寶，具有廣闊的應(yīng)用前景。

在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，增殖和遷移是其主要特性，是惡性腫瘤預(yù)后不良及導(dǎo)致死亡的主要原因之一，因此，通過藥物抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和增殖，是癌癥治療的手段之一［6-7］。

宮頸癌在女性惡性腫瘤中位居首位，本文用MTT法觀察GBEP對宮頸癌細(xì)胞株Siha增殖的抑制作用。結(jié)果表明，GBEP對Siha細(xì)胞的增殖具有抑制作用，在10～320 μg/mL劑量下，體外作用24～72 h，GBEP對 Siha細(xì)胞體外增殖的抑制率隨劑量增加和時間延長而增加，具有劑量依賴性和時間依賴性，這與GBEP對其他癌細(xì)胞的研究結(jié)果相符，在GBEP對胃癌細(xì)胞及肝癌細(xì)胞的研究中有相似性。

在對細(xì)胞遷移作用的研究中，銀杏外種皮多糖對宮頸癌細(xì)胞的遷移，同樣起到了抑制作用，當(dāng)GBEP劑量為40 μg/mL，與對照細(xì)胞相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，80 μg/mL以上時，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，表明GBFP對Siha細(xì)胞的遷移具有抑制作用。同時，應(yīng)用Real Time PCR方法檢測了與細(xì)胞遷移相關(guān)的MMP-2基因，基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metallo proteinases，MMPs)是鋅肽酶，是一種能降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解酶，MMPs的表達(dá)和活化與腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在惡性腫瘤中MMPs經(jīng)常過度表達(dá)［8］，其對腫瘤的侵蝕、轉(zhuǎn)移有非常重要的作用。因此，MMPs被認(rèn)為是癌癥患者的預(yù)后因子和治療靶點。Real Time PCR檢測結(jié)果表明，隨著GBEP濃度的增加，Siha細(xì)胞MMP-2表達(dá)量降低，這個結(jié)果也與 ELISA檢測結(jié)果相同，共同證明GBEP對宮頸癌細(xì)胞Siha細(xì)胞遷移的抑制作用。

綜上所述，銀杏外種皮多糖對宮頸癌細(xì)胞Siha細(xì)胞的生長增殖和遷移侵襲具有抑制作用，在分子水平初步證明其具有抑制Siha細(xì)胞遷移相關(guān)基因的表達(dá)，為GBEP應(yīng)用于宮頸癌治療的可能性提供依據(jù)。

［1］ 許愛華，陳華圣.銀杏外種皮多糖對人癌細(xì)胞系的抑制作用及與阿霉素的協(xié)同效應(yīng)［J］.中國新藥雜志，2000，9(11):753-755.

［2］ 陳群，楊桂文.銀杏露果多糖的免疫調(diào)節(jié)活性與抗腫瘤作用［J］.中國實用醫(yī)藥雜志，2004，54(10):29.

［3］ 朱月清，周振英，陳華圣，等.銀杏外種皮多糖抑制小鼠肝癌及誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的研究［J］.中國新藥與臨床藥理，2001，12(5):98-102.

［4］ Itokawa H，Totsuka N，Nakahara K，et al.Antitumor principles from Ginkgo bilobaL［J］.Chem Pharm Bull，1987，35(7):3016.

［5］ Ji Su KL，You Sun C，Eun JungP，et al.Phospholipase C1 inhibitory principles from the sarcotestas of Ginkgo biloba［J］.J Nat Prod，1998，61:867.

［6］ 鄭小冬，呂杰強(qiáng)，朱雪瓊，等.抗氧化劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽對宮頸癌Siha細(xì)胞增殖和凋亡的影響［J］.實用醫(yī)學(xué)雜志，2009，25(22):3743-3746.

［7］ 錢德英，歐陽云雁，趙楊，等.RNAi干擾HPV16E6基因?qū)m頸癌 Siha細(xì)胞的影響［J］.實用醫(yī)學(xué)雜志，2010，26(9):1505-1507.

［8］ 陳曉鋒，顧振綸，梁忠琴，等.基質(zhì)金屬蛋白酶與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移研究進(jìn)展［J］.中國藥理學(xué)通報，2001，17(3):253-257.