劉爭(zhēng)杰 趙自剛 趙永泉 牛春雨 張玉平 司永華 張立民

腸缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)引起的腸系膜上動(dòng)脈閉塞性(Superior Mesenteric Artery Occlusion,SMAO)休克,是臨床常見的危重病理過程,常見于休克復(fù)蘇、器官移植術(shù)后、嚴(yán)重創(chuàng)傷救治過程等。研究表明,腸源性細(xì)菌內(nèi)毒素經(jīng)腸淋巴途徑移位至全身是二次打擊、失血性休克導(dǎo)致多器官損傷的重要機(jī)制[1,2],腸淋巴液是危重病發(fā)展的橋梁[3,4]。以“腸缺血-再灌注”為基礎(chǔ),將“夾閉腸系膜淋巴管(Mesenteric Lymph Duct,MLD)阻斷淋巴液回流1h,再行淋巴液灌注”稱為“腸淋巴再灌注”(Mesenteric Lymph Reperfusion,MLR);單純MLR對(duì)機(jī)體不造成損害,但可加劇SMAO休克這一病理過程中的多器官損傷,降低SMAO休克大鼠平均動(dòng)脈壓及24h存活率[5],其機(jī)制與MLR加重多個(gè)器官的自由基損傷、一氧化氮釋放、組織細(xì)胞膜泵功能障礙有關(guān)[6]。為進(jìn)一步探討MLR加重SMAO休克大鼠多器官損傷的作用機(jī)制,本文觀察了M LR對(duì)SMAO休克大鼠肺、心肌、腎、肝組織細(xì)胞間黏附分子-1(Intercellular Adhesion Molecule-1,ICAM-1)、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(Receptor of Advanced Glycation End-Products,RAGE)含量的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法

24只 SPF級(jí) Wistar雄性大鼠(體重 280～330g,購自中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)經(jīng)肌肉注射1%戊巴比妥鈉(50mg/kg體重,德國,北京化學(xué)試劑公司分裝,批號(hào):071201)全身麻醉后,行右股部手術(shù),分離股動(dòng)脈與股靜脈,股動(dòng)脈插管連壓力換能器接RM6240BD型生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈血壓,股靜脈給予肝素鈉溶液(1ml/kg體重,即500U/kg體重)全身抗凝;行腹部手術(shù),暴露腸系膜根部,游離腸系膜上動(dòng)脈(Superior Mesenteric Artery,SMA),仔細(xì)分離與SMA相伴行的MLD。血壓穩(wěn)定10min后進(jìn)行下述操作并依次進(jìn)行分組:Sham組:在SMA和MLD下穿線,不夾閉;SMAO組:以無創(chuàng)血管夾夾閉SMA根部 60min后,開夾再灌注120min,復(fù)制SMAO休克大鼠模型;MLR組:以無創(chuàng)血管夾夾閉MLD根部 60min后,開夾再灌注120min,實(shí)施 MLR;SMAO+MLR組:同時(shí)夾閉SMA和 MLD根部60min后,開夾再灌注120min。

1.2 取材與標(biāo)本制備

所有動(dòng)物經(jīng)再灌注120min、大量注射戊巴比妥鈉(120mg/kg體重)麻醉后(Sham組在相同時(shí)間點(diǎn)),迅速選擇固定位置,留取肺、心肌、肝、腎組織,放入無菌EP管,置于-80℃低溫冰箱(Forma-86C,美國熱電)冷藏。實(shí)驗(yàn)前取出,加5倍量冷生理鹽水,用FJ-200型高速分散勻質(zhì)機(jī)(上海標(biāo)本模型廠)制備組織勻漿(濃度為 16.7%),使用 Labofuge 400R型高速低溫離心機(jī)(德國科峻)離心后留取上清,用于相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)方法

采用ELISA測(cè)定各器官組織勻漿中ICAM-1、RAGE含量(試劑盒由美國R&D公司生產(chǎn)、江蘇希望生物科技有限公司代理),嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線制備、樣本測(cè)定;終止反應(yīng)后,將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀(Stat Fax-2100型,美國STAT-FAX公司)槽內(nèi),選擇450nm波長(zhǎng)檢測(cè)其OD值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后,計(jì)算各樣本結(jié)果。各組織勻漿蛋白定量采用考馬斯亮藍(lán)法(試劑盒購自南京建成生物工程研究所)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包處理,計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),方差齊(P＞0.10)的資料多組間比較采用單因素方差分析,組內(nèi)自身比較應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn);方差不齊者(P≤0.10),采用Kruskal Wallis檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MLR對(duì)SMAO休克大鼠各器官組織勻漿ICAM-1含量的影響

MLR組肺、腎、肝、心肌組織勻漿中的 ICAM-1含量與Sham組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;SMAO組和SMAO+MLR組肺、腎、肝、心肌組織勻漿中ICAM-1含量高于Sham組及MLR組(P＜0.01),且SMAO+MLR組肺、腎、肝、心肌組織勻漿ICAM-1含量顯著高于SMAO組(P均＜0.01),見表1。

表1 MLR對(duì)SMAO休克大鼠各器官組織勻漿ICAM-1含量的影響(ng/g protein,±s,n均=6)

表1 MLR對(duì)SMAO休克大鼠各器官組織勻漿ICAM-1含量的影響(ng/g protein,±s,n均=6)

注:與Sham 組比較,1)P＜0.01;與M LR組比較,2)P＜0.01;與SM AO組比較,3)P＜0.01

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2.2 MLR對(duì)SMAO休克大鼠各器官組織勻漿RAGE含量的影響

由表2可見,MLR組與Sham 組肺、腎、肝、心肌組織勻漿中RAGE含量無顯著差異;SMAO組與SMAO+MLR組肺、腎、肝、心肌組織勻漿RAGE含量均顯著高于Sham組與M LR組(P＜0.01),且SMAO+MLR 組肺 、腎、肝 、心肌組織勻漿RAGE含量均顯著高于SMAO組(P＜0.01)。

表2 MLR對(duì)SMAO休克大鼠各器官組織勻漿RAGE含量的影響(ng/g protein,±s,n均=6)

表2 MLR對(duì)SMAO休克大鼠各器官組織勻漿RAGE含量的影響(ng/g protein,±s,n均=6)

注:與Sham 組比較,1)P＜0.01;與M LR組比較,2)P＜0.01;與SM AO組比較,3)P＜0.01

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3 討 論

隨著對(duì)腸淋巴系統(tǒng)在危重病發(fā)病學(xué)中作用的深入研究[3～8],現(xiàn)已認(rèn)識(shí)到腸淋巴液回流參與了腸I/R后SMAO休克致遠(yuǎn)隔器官的炎癥反應(yīng)與組織損傷。Cavriani等[9]夾閉SMA 45min、開夾再灌注2h后發(fā)現(xiàn),腸I/R可致肺的多形核中性粒細(xì)胞(Polymerphonuclear Neutrophil,PMN)聚集、微血管通透性增高、炎癥介質(zhì)水平升高;而結(jié)扎大鼠MLD可減輕腸I/R及其導(dǎo)致的肺損傷;Badami等[10]的研究也表明,結(jié)扎MLD可提高SMAO大鼠的存活率;Cox等[11]將犬腸缺血1h、再灌注3h,其心肌含水量較基礎(chǔ)值增高、等容舒張及-dp/dtmax顯著降低、PMN生成的過氧化產(chǎn)物增多、心肌髓過氧化物酶活性增強(qiáng),而淋巴液轉(zhuǎn)流的犬,其腸I/R后心肌的上述各指標(biāo)均接近基礎(chǔ)值,提示腸I/R所引起的心功能紊亂是由于淋巴液回流所引起。這些研究均表明,腸I/R后的腸淋巴液回流均參與了其后的遠(yuǎn)隔器官炎癥和損傷。

本項(xiàng)目組在針對(duì)腸淋巴途徑與SMAO休克多器官損傷發(fā)病學(xué)的研究中發(fā)現(xiàn),SMAO休克的發(fā)生與有無MLR的影響有很大相關(guān)性,提示臨床在I/R損傷的防治策略中,應(yīng)充分考慮腸淋巴途徑的發(fā)病學(xué)作用,在可能引起I/R損傷的諸多治療中,有效防止淋巴管擠壓及其后的再灌注,對(duì)預(yù)防I/R導(dǎo)致遠(yuǎn)隔器官的損傷、提高治愈率可能是有效途徑之一[5,6,12]。鑒于MLR加重SMAO休克多器官損傷的作用機(jī)制與加劇炎癥反應(yīng)有關(guān),本研究從啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的多個(gè)環(huán)節(jié),探討MLR加重SMAO休克器官炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制。

研究表明,PMN作為炎性因子釋放的炎細(xì)胞,在炎癥反應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)中起重要作用,因此,PMN扣押于組織,是組織器官炎癥反應(yīng)失衡的重要因素[13]。本項(xiàng)目組在前期研究中發(fā)現(xiàn) MLR加重SMAO休克器官損傷的作用機(jī)制與髓過氧化物酶增高有關(guān)[6],提示MLR可引起PMN在組織器官的扣押;同時(shí),由于ICAM-1表達(dá)上調(diào)可促使PMN和血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附與激活,并跨越血管壁,穿出血管外,在組織中聚集和浸潤(rùn),引起局部組織釋放更多的炎癥介質(zhì)[14],進(jìn)一步加重組織損傷。本研究應(yīng)用ELISA檢測(cè)各器官組織勻漿的ICAM-1水平后發(fā)現(xiàn),單純MLR組與Sham 組的肺、腎、肝、心肌組織ICAM-1含量無明顯變化,SMAO組肺、腎、心肌、肝組織ICAM-1含量顯著高于MLR和Sham組,SMAO+MLR組肺、腎、心、肝組織的ICAM-1含量顯著高于SMAO、MLR和Sham組,提示M LR可增加SMAO休克大鼠器官的ICAM-1含量,從而引起PMN扣押于組織增多,最終加重組織器官的炎癥反應(yīng)。

Uchida等[15]研究發(fā)現(xiàn),RAGE是Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞損傷的一種標(biāo)記物,與急性肺損傷相關(guān);Van Zoelen等[16]在大腸桿菌性膿毒癥模型中發(fā)現(xiàn),未受損的RAGE信號(hào)通路有利于建立有效的抗菌防御體系;Unoshima等[17]在研究全身炎癥反應(yīng)綜合征或膿毒血癥時(shí)發(fā)現(xiàn),脂多糖(LPS)所致急性肺損傷經(jīng)過抗體治療后(抑制RAGE表達(dá)),損傷癥狀基本消失;這些研究表明,RAGE在炎癥反應(yīng)啟動(dòng)過程中具有重要作用。本研究檢測(cè)各器官組織勻漿中RAGE的含量后發(fā)現(xiàn),SMAO組、SMAO+M LR組肺、腎、心肌、肝組織 RAGE含量均高于 MLR和Sham組,且 SMAO+MLR組RAGE含量高于SMAO組,提示MLR加重SMAO休克大鼠器官炎癥反應(yīng)的機(jī)制與RAGE增多有關(guān)。

綜上所述,MLR可增加SMAO休克大鼠各器官的ICAM-1含量,成為PMN黏附、扣押于組織、加劇炎癥反應(yīng)的主要機(jī)制;同時(shí),MLR還增加SMAO休克大鼠各器官的 RAGE含量,成為炎癥反應(yīng)加劇的又一因素。以腸淋巴途徑為研究靶點(diǎn),對(duì)于SMAO休克后多器官損傷的防治具有一定的作用與意義。至于 RAGE通過哪一條途徑發(fā)揮MLR加重SMAO休克的炎癥反應(yīng)過程,有待進(jìn)一步探討。