張丙秀 李景富 王傲雪 許向陽

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

細(xì)胞壁成分的解離是果實(shí)軟化的直接原因（Fischer & Bennett，1991），番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）果實(shí)細(xì)胞壁主要由半纖維素、纖維素、果膠和蛋白組成，占干物質(zhì)質(zhì)量的90 %（Redgwell & Fischer，2002），番茄果實(shí)半纖維素中的甘露糖多以甘露聚糖的形態(tài)存在（Seymour et al.，1990），甘露聚糖酶（Endo-β-1, 4-mannanas）的功能就是水解甘露聚糖之間的β-1, 4共價鍵（Bewley，1997）。番茄不成熟突變體及一些能正常成熟品種果實(shí)中甘露聚糖酶活性很低或沒有活性，這些品種果實(shí)的軟化程度較慢（Bewley et al.，2000；Banik et al，2001），所以該酶可能與果實(shí)的軟化相關(guān)，但還不明確該酶在果實(shí)軟化中是否起到重要作用。目前，番茄果實(shí)中的甘露聚糖酶基因已經(jīng)被克隆出來，被命名為LeMan4基因（Carrington et al.，2002）。反義 RNA技術(shù)是研究基因功能的一種有效途徑（宋艷茹和馬慶虎，1995），該技術(shù)在油菜（Knutzon et al.，1992）、蘋果（Dandekar et al.，2004）、西洋梨（Gao et al.，2007）等作物上得到了成功的應(yīng)用。在蔬菜學(xué)領(lǐng)域，研究較深入的就是耐貯運(yùn)番茄的培育，Hamilton等（1990）將ACC氧化酶的反義RNA導(dǎo)入番茄植株，使成熟果實(shí)的乙烯產(chǎn)生受到97 %的抑制，轉(zhuǎn)基因番茄在室溫下的貯存時間明顯比對照長。反義RNA技術(shù)在保鮮貯存方面研究的誘人前景，已成為選育耐貯藏果樹新品種有效的途徑之一（Petri & Burgos，2005）。鑒于此，本試驗(yàn)構(gòu)建了LeMan4基因反義表達(dá)載體并將其導(dǎo)入番茄基因組，以期獲得LeMan4基因表達(dá)的缺陷型植株，探討LeMan4基因在番茄果實(shí)軟化中的作用，并為選育耐貯番茄新品種提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

植物材料：番茄品種Micro-Tom，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄課題組提供。

菌株及載體：大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌EH105及載體pBI121，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄課題組提供。

試劑：LA Taq DNA聚合酶、DL 2000marker、各種限制性內(nèi)切酶（SmaⅠ、SacⅠ及HindⅢ）、RT-PCR試劑盒購于 TaKaRa公司；膠回收試劑盒購自上海華舜公司；pGEM-Teasy Vector，T4DNA連接酶為Promaga公司的產(chǎn)品；MS Salts為Sigma公司產(chǎn)品；Trizol及引物購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；Southern 雜交采用羅氏的地高辛試劑盒；其他試劑均為國產(chǎn)的分析純。

1.2 方法

1.2.1 果實(shí)硬度的測定 按照不同成熟度分為4個時期采果實(shí)測定：G，綠熟期（果實(shí)亮白，或轉(zhuǎn)色面積不超過10 %）；T，轉(zhuǎn)色期（果實(shí)表面10 %～60 %轉(zhuǎn)為淡黃或紅色）；OR，橙紅期（果實(shí)表面60 %以上轉(zhuǎn)為全黃或紅色）；R，紅熟期（果實(shí)著色為全黃或全紅）。

每個處理5個果實(shí)，采用手持式果實(shí)硬度計（FHM5），沿番茄果實(shí)赤道線中部（即果實(shí)最大橫徑處）對著心室腔隨機(jī)取3點(diǎn)測試硬度，取平均值。

1.2.2 番茄果皮總RNA提取及LeMan4 cDNA的克隆 番茄果皮總RNA提取依照Trizol試劑的說明書進(jìn)行。

根據(jù)Genebank登陸的LeMan4 cDNA序列設(shè)計引物，兩條引物的5' 端插入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，并在酶切位點(diǎn)之外再加上了兩個保護(hù)堿基，在上游引物的5' 端加上AACA框和起始密碼子。上游引物（P1）：5' TCCCCCGGGAACAATG CTATGATAGCTTAGAGAGCC，下游引物（P2）：5' CGAGCTC CTAATGAATAACTCAATCATCTTAATTTTTG。

以番茄果皮總RNA為模板，P1、P2為PCR 引物進(jìn)行RT-PCR。cDNA第一鏈的合成反應(yīng)條件為30 ℃ 5min，42 ℃ 3 h，95 ℃ 5min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶；PCR反應(yīng)條件：94 ℃變性5min，94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環(huán)，最后72 ℃保溫10min。獲得的PCR產(chǎn)物純化后克隆到pGEM-Teasy上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和質(zhì)粒酶切初步鑒定后測序，獲得克隆載體。

1.2.3 LeMan4反義基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建 用 SmaⅠ和 SacⅠ將克隆載體上的目的基因切下，插入載體pBI121的相應(yīng)克隆位點(diǎn)，構(gòu)建植物表達(dá)載體（圖1）。采用菌落PCR法和限制性內(nèi)切酶酶切法進(jìn)行鑒定。

1.2.4 反義LeMan4的轉(zhuǎn)化及檢測分析 采用凍融法將表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌 EHA105（王關(guān)林和方宏筠，2002）。葉盤法轉(zhuǎn)化番茄（McCormick et al.，1986）。將番茄種子用70 %乙醇浸泡30 s后，用10 %次氯酸鈉消毒15min，接種于無菌苗培養(yǎng)基（MS+蔗糖15g·L-1+瓊脂 7 g·L-1），置于（26±2）℃、16h光照培養(yǎng)，待子葉展開時，在無菌條件下切下子葉放在培養(yǎng)基（MS+NAA 1mg·L-1+BAP 1mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1+瓊脂 8g·L-1）中預(yù)培養(yǎng)1d。挑取pBI121-RLeMan4單菌落，接種于5mL含卡那霉素50mg·L-1的YEP液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r·min-1振蕩過夜培養(yǎng)，菌液長至OD600=0.4～0.6時，按1∶10的比例稀釋菌液，再進(jìn)行二次活化，OD600=0.5～0.6時，4 ℃、2000 r·min-1離心 10min，收集細(xì)菌細(xì)胞，用 2 % MS液體培養(yǎng)基懸浮沉淀至OD600=0.5左右，以該菌液對外植體進(jìn)行侵染。將預(yù)培養(yǎng)后的外植體放入農(nóng)桿菌菌液中侵染 20min，其間輕輕搖動幾次，放入共培養(yǎng)基（MS+NAA 1mg·L-1+BAP 1mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂8g·L-1）中48h后，轉(zhuǎn)移至芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基〔MS+頭孢噻肟鈉500mg·L-1+卡那霉素50mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1+瓊脂 7 g·L-1+ZT 2mg·L-1（14d后 ZT 1mg·L-1）〕，每隔 14d繼代1次，以未侵染的子葉為對照，形成芽的外植體切成小塊轉(zhuǎn)移到芽伸長培養(yǎng)基（MS+ZT 1mg·L-1+GA 1mg·L-1+蔗糖 15g·L-1+瓊脂7 g·L-1+頭孢噻肟鈉500mg·L-1+卡那霉素40mg·L-1），每隔10d繼代1次，當(dāng)芽長至2～4cm時切離外植體，轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基（MS+IBA 1mg·L-1+蔗糖15g·L-1+瓊脂8g·L-1+頭孢噻肟鈉500mg·L-1+卡那霉素40mg·L-1）。植株長到5cm可馴化移栽到土中。

再生番茄植株的基因組 DNA采用 CTAB法提取。根據(jù) NptⅡ序列設(shè)計引物：上游引物為5' ACTGGGCACAACAGACAA 3'，下游引物為5' CCGTAAAGCACGAGGAA 3'，以再生番茄基因組DNA為模板，進(jìn)行抗性植株的PCR檢測，PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5min，94 ℃變性1min，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1min，35個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 ℃ 10min，4 ℃ 30min，終止反應(yīng)。取PCR陽性植株基因組DNA 5～10μg，經(jīng)Hind Ⅲ單酶切，以標(biāo)記的NptⅡ探針進(jìn)行Southern 雜交檢測。

圖1 反義表達(dá)載體pBI121-RLeMan4

2 結(jié)果與分析

2.1 LeMan4 cDNA的克隆、反義LeMan4植物表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化

提取番茄果皮 RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，P1和 P2為引物，55 ℃進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳分析表明PCR 產(chǎn)物的長度在1200 bp左右，如圖2。PCR 產(chǎn)物回收后與載體T-easy vector連接，酶切鑒定后（圖3），交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。測序結(jié)果在Genebank上經(jīng)Blast 比對與番茄果實(shí)LeMan4 cDNA序列同源性達(dá)100 %，將此克隆命名為 T-LeMan4。分別用限制性內(nèi)切酶 SacⅠ和 SmaⅠ雙酶切 pBI121質(zhì)粒及T-LeMan4質(zhì)粒?；厥誴BI121酶切產(chǎn)物的較大片斷及T-LeMan4的小片斷，二者4 ℃過夜連接。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，然后涂布在含有卡那霉素（50mg·L-1）的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜后選取菌落用于PCR檢測，檢測為陽性的菌落的質(zhì)粒用SacⅠ和SmaⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，如圖4。pBI121切下大小為1800 bp左右的GUS片斷，質(zhì)粒切下的片斷大小為 1200 bp，證明 LeMan4反義基因已連接到 pBI121上。采用凍融法將重組質(zhì)粒pBI121-RLeMan4轉(zhuǎn)化制備好的農(nóng)桿菌EHA105的感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)含Km（50mg·L-1）+Rif（50mg·L-1）的YEB 平板篩選，挑取轉(zhuǎn)化菌落，堿裂解法小量提取質(zhì)粒后，進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，如圖5。結(jié)果證明pBI121-RLeMan4已成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA105。

圖2 RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果分析

圖3 SacⅠ/SmaⅠ雙酶切T-LeMan4

圖4 pBI121-RLeMan4雙酶切檢測

圖5 pBI121-RLeMan4轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌雙酶切檢測

2.2 番茄的遺傳轉(zhuǎn)化

無菌條件下切下無菌苗子葉放于預(yù)培養(yǎng)基中培養(yǎng)1d后進(jìn)行侵染。共培養(yǎng)48h后轉(zhuǎn)移至芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)，14d后對照變白最后死亡，形成芽的外植體切成小塊轉(zhuǎn)移到芽伸長培養(yǎng)基，每隔10d繼代1次，當(dāng)芽長至2～4cm時切離外植體，轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基。植株長到5cm馴化移栽到土中。植株長至10cm定植到溫室。番茄品種Micro-Tom的遺傳轉(zhuǎn)化過程見圖6，最終得到反義RNA抗性植株20株。

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的分子生物學(xué)

2.3.1 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測 提取的抗性苗葉片總DNA經(jīng)0.8 %瓊脂糖檢測表明質(zhì)量較好，可以用于PCR擴(kuò)增。根據(jù)NptⅡ序列引物，以質(zhì)粒為陽性對照，非轉(zhuǎn)基因植株為陰性對照，對獲得的再生植株進(jìn)行PCR檢測，擴(kuò)增片斷長度為667 bp。擴(kuò)增結(jié)果如圖7。20株抗性植株中有13株表現(xiàn)為陽性。

2.3.2 轉(zhuǎn)基因植株的Southern Blot檢測 以質(zhì)粒pBI121-RLeMan4為模板，利用NptⅡ基因片段設(shè)計的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后回收PCR產(chǎn)物制備探針。提取 PCR檢測為陽性植株的總DNA，經(jīng)HindⅢ酶切，以標(biāo)記的NptⅡ探針進(jìn)行Southern雜交。由圖8可見，在雜交后的膜上出現(xiàn)了雜交帶，而陰性對照（非轉(zhuǎn)基因植株）無雜交帶。由此推斷，NptⅡ基因片段已經(jīng)整合到番茄的基因組中。最終，得到陽性的轉(zhuǎn)基因植株11株。

圖6 番茄葉片再生及抗性植株篩選

圖7 pBI121-RLeMan4轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測

圖8 pBI121-RLeMan4轉(zhuǎn)化番茄的Southern檢測

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的甘露聚糖酶活性及硬度檢測

轉(zhuǎn)基因植株溫室定植后，成活7株。從圖9可以看出，在綠熟期和轉(zhuǎn)色期，甘露聚糖酶的活性被完全抑制，橙紅期后，各轉(zhuǎn)基因果實(shí)又檢測到甘露聚糖酶活性，但都在非轉(zhuǎn)基因植株的12.2 %以下。在轉(zhuǎn)色期和橙紅期，果實(shí)硬度比對照高出較多，品系R7在橙紅期比對照高出18.2%。紅熟期后各轉(zhuǎn)基因植株果實(shí)與對照硬度的差距減小。這可能是番茄果實(shí)內(nèi)源甘露聚糖酶基因在橙紅期后轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)的結(jié)果。

圖9 轉(zhuǎn)基因植株果實(shí)甘露聚糖酶活性的變化

圖10 轉(zhuǎn)基因植株果實(shí)硬度的變化

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)從Micro-Tom果實(shí)得到甘露聚糖酶基因，并構(gòu)建出反義RNA表達(dá)載體pBI121-R LeMan4。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化番茄，獲得PCR陽性植株13株，Southren雜交陽性植株11株，為研究該基因在番茄果實(shí)成熟軟化中的作用提供了試材。各轉(zhuǎn)基因植株果實(shí)的甘露聚糖酶活性被抑制在12.2 %以下，但都能夠成熟和軟化，只是果實(shí)硬度比對照高，這說明甘露聚糖酶活性與果實(shí)軟化有關(guān)，但卻不是番茄果實(shí)成熟軟化的必要因子。

利用反義 RNA技術(shù)對基因的表達(dá)進(jìn)行抑制可以產(chǎn)生突變體，從而研究特定基因?qū)?xì)胞發(fā)育、分化及功能的影響，該技術(shù)在一些作物上得到了成功的應(yīng)用。本試驗(yàn)通過反義 RNA 技術(shù)獲得了LeMan4表達(dá)缺陷植株，但沒有對轉(zhuǎn)基因植株果實(shí)的LeMan4的基因表達(dá)量進(jìn)行檢測，但其抑制效果已經(jīng)在生理水平上進(jìn)行驗(yàn)證。

本試驗(yàn)結(jié)果證明甘露聚糖酶活性與果實(shí)軟化有關(guān)，但甘露聚糖只占細(xì)胞壁成分的一小部分（Huysamer et al.，1997）。所以，甘露聚糖的降解可能通過間接途徑影響了果實(shí)軟化。例如，甘露聚糖降解所產(chǎn)生的甘露糖或甘露聚糖的寡糖可能用于半纖維素的重新合成（Bewley et al.，2000），這就有可能改變細(xì)胞壁中半纖維素、纖維素及果膠的連接方式，影響細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，使細(xì)胞壁更容易被其他水解酶降解。另外，本試驗(yàn)中甘露聚糖酶的活性雖然被抑制在較低水平，但轉(zhuǎn)基因果實(shí)仍能成熟，只是硬度的變化受到影響，這說明甘露聚糖酶活性不是番茄果實(shí)成熟軟化的必要因子，甘露聚糖酶很可能與其他細(xì)胞壁降解酶或修飾酶等協(xié)同作用，共同參與果實(shí)發(fā)育（王傲雪 等，2006）。但以上推測還需以獲得的轉(zhuǎn)基因果實(shí)為試材進(jìn)行一系列的生理學(xué)、蛋白組學(xué)驗(yàn)證。

宋艷茹，馬慶虎.1995.反義RNA與植物基因表達(dá)調(diào)控.植物分子生物學(xué)——成就與前景.北京：科學(xué)出版社：268-278

王關(guān)林，方宏筠.2002.植物基因工程.北京：科學(xué)出版社：397-400

王傲雪，張丙秀，李景富.2006.β-1,4-甘露聚糖內(nèi)切酶在番茄發(fā)育中的作用.園藝學(xué)報，33（5）：1157-1161

Banik M，Bourgault R，Bewley J D.2001.Endo-β-mannanase is present in an inactive form in ripening tomato fruits of the curtivar Walter.J Exp Bot，52：105-111.

Bewley J D.1997.Breaking down the walls-a role for endo-β-mannanase in release from seed dormancy？Trends in Plant Sci，2（12）：464-469

Bewley J D，Banik M，Bourgault R，F(xiàn)eurtado J A，Toorop P，Hilhorst H W M.2000.Endo-β-mannanase increases in the skin and outer pericarp of tomato fruits during ripening.J Exp Bot，51：529-538

Carrington cm S，Vendrell M，Dominguez-Puigjaner E.2002.Characterisation of an endo-（1,4）-beta-mannanase （LeMAN4）expressed in ripening tomato fruit.Plant Sci，163（3）：599-606

Dandekar A M，Teo G，Defilippi B G，Uratsu S L，PasseyA J，Kader A A，Stow J R，Colgan R J，James D J.2004.Effect of down-regulation of ethylene biosynthesis on fruit flavor complex in apple fruit.Transgenic Res，13（4）：373 -384

Fischer R L，Bennett A B.1991.Role of cell wall hydrolases in fruit ripening.Annual Review of Plant Physiology and Plantmolecular Biology，42：67-73

Gao M，Matsuta N，Murayama H，Toyomasu T，MitsuhashiW，DandekarA M，Tao R，Nishimura K.2007.Gene expression and ethylene production in transgenic pear（Pyrus communis cv.‘La France’）with sense or antisense cDNA encoding ACC oxidase.Plant Sci，173（1）：32-42

Hamilton A J，Lycett G W，Grenson D.1990.Antisense gene that inhibits synthesis of the hormone ethylene in transgenic plants.Nature，346（29）：284-287

Huysamer M，Greve C，Labavitch J M.1997.Cell wall metabolism in ripening fruit.Ⅷ.Cell wall composition and synthetic capacity of two regions of the outer pericarp of mature green and red ripe cv.Jackpot tomatoes.Physiol Plant，101：314-322

Knutzon D S，Thompson G A，Radke S E，Johnson W B，Knauf V C，Kridl J C.1992.Modification of Brassiea seed oil by antisense expression of a stearoyl-acyl carrier protein desaturase gene.Proc Natl Acad Sci USA，89：2624-2628

McCormick S，Niedermeyer J，F(xiàn)ry J，Barnason A，Horsch R，F(xiàn)raley R.1986.Leaf disc transformation of cultivated tomato（L.esculentum）using Agrobacterium tumefa-ciens.Plant Cell Rep，5：81–84.

Petri C，Burgos L.2005.Transformation of fruit trees.Useful breeding tool or continued future prospect? Transgenic Res，14（1）：15-26

Redgwell R J，F(xiàn)ischer M.2002.Fruit texture：cell wall metabolism and consumer perception//Knee M.Fruit quality and its biological basis.Sheffield：Sheffield Academic Press：46-87

Seymour G B，Colquhoun I J，Dupont M S，Parsley K R，Sevendran R R.1990.Composition and structural features of cell wall polysaccharides from tomato fruits.Phytochemistry，29：725-731