王冬梅 陳 琛，2 王慶彪 莊 木* 劉玉梅 楊麗梅張揚勇 方智遠

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 青島 266109）

芥藍（Brassica oleracea var. alboglabra Baily），又名白花芥藍、芥蘭，是十字花科蕓薹屬一年或兩年生草本植物，2n=18，在我國廣東、廣西、福建和臺灣等地廣泛種植（Panda et al.，2003；秦耀國 等，2009；張平真，2009；周禹 等，2010）。有關(guān)甘藍類作物起源和親緣關(guān)系的信息多數(shù)來自史料記載（Helm，1963；Thompson，1976；張平真，2009）：普通結(jié)球甘藍和紫甘藍大約在13世紀起源于德國；皺葉甘藍可能原產(chǎn)于意大利；抱子甘藍形成于比利時的布魯塞爾；Boswell（1949）認為球莖甘藍是15世紀在歐洲北部演化而成；花椰菜可能是在1490年由熱那亞人從黎凡特或者塞浦路斯引入意大利；青花菜由黎凡特、塞浦路斯或者克里特島引入意大利；芥藍的起源有中國南方起源說和地中海沿岸起源說兩種，尚缺乏充分的分子生物學(xué)證據(jù)。

SSR標記由于其多態(tài)性好以及共顯性的特點（Powell et al.，1996），越來越多地應(yīng)用于基因標記、圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析等方面（陳全求 等，2008）。與基因組SSR相比，EST-SSR作為功能基因的一部分，在功能基因鑒定和種間通用性上更有其優(yōu)越性（Gupta et al.，2003）。本試驗利用甘藍 EST-SSR標記，對芥藍、野生甘藍、觀賞羽衣甘藍、苤藍、皺葉甘藍、結(jié)球甘藍、紫甘藍、抱子甘藍、青花菜和花椰菜等甘藍類材料進行遺傳多樣性分析，比較芥藍與其他甘藍類作物之間的親緣關(guān)系，為芥藍起源提供分子證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料包括甘藍類作物自交系、地方品種、一代雜種和野生甘藍等38份。其中3份野生甘藍由英國國際園藝研究中心（Warwick HRI，UK）引進，5份芥藍地方品種由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)雷建軍教授提供，花椰菜由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所花椰菜課題組提供，其余材料由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所甘藍課題組收集、提供（材料編號和名稱見表 1）。所有材料于2009、2010年定植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所南口實驗農(nóng)場，在芥藍成熟期調(diào)查其植物學(xué)性狀，調(diào)查標準參照《芥藍種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》（李錫香和方智遠，2008）。苗期取幼嫩葉片，采用改良CTAB法提取DNA。

表1 供試38份甘藍類材料名稱、類型及來源

1.2 EST-SSR分析

試驗所用EST-SSR引物參見陳琛等（2010）的文獻，利用8份不同甘藍變種的材料進行引物初篩，篩選出61對EST-SSR引物，并對所有38份材料進行擴增分析。PCR反應(yīng)體系為10μL，其中包括：200μmol·L-1dNTPs，上鏈和下鏈引物各2.5 pmol，0.5 U Taq酶，1×Buffer（內(nèi)含1.5mmol·L-1MgCl2），25 ng DNA模板，所用試劑均購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司。PCR擴增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4min；94 ℃變性30 s，合適溫度退火30 s，72 ℃延伸1min，35個循環(huán)；72 ℃延伸7min。各引物的合適退火溫度根據(jù)引物合成報告單而定。8 %聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，160 V恒壓。快速銀染法染色。

1.3 數(shù)據(jù)分析

在相同遷移率位置上，有帶記為1，無帶記為0，缺失記為999。為保證數(shù)據(jù)準確、可靠，每塊膠板均由兩人獨立記錄，然后比對，有爭議的數(shù)據(jù)作缺失處理。應(yīng)用NTSYSpc2.11軟件采用非加權(quán)類平均法（UPGMA）進行聚類分析，得到遺傳相似系數(shù)，根據(jù)遺傳相似系數(shù)建立聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 EST-SSR擴增分析

本試驗利用8個具有代表性的材料對EST-SSR引物多態(tài)性進行篩選，共得到61對擴增穩(wěn)定、條帶清晰、品種間帶型差異較明顯、易于識別的引物。用這61對EST-SSR引物對38份甘藍類材料擴增，共擴增出174條多態(tài)性條帶，每對引物擴增的等位位點數(shù)不等，變幅為1～5，平均每對引物擴增2.86條帶，引物多態(tài)性總體較好。其中，引物BoE332在38份材料中的擴增結(jié)果見圖1。

圖1 引物BoE332在部分甘藍類作物中的SSR擴增結(jié)果

2.2 芥藍與其他甘藍類作物EST-SSR標記的聚類分析

根據(jù)擴增結(jié)果建立數(shù)據(jù)矩陣后用NTSYSpc2.11軟件計算不同甘藍變種間的遺傳相似系數(shù)，UPGMA法進行聚類分析得到38份甘藍類材料的聚類分析樹狀圖（圖2）。

由圖2可知，在相似系數(shù)大約為0.62處，所選甘藍材料按地域分為三大類群：Ⅰ野生甘藍、觀賞羽衣甘藍、結(jié)球甘藍、紫甘藍、皺葉甘藍、苤藍和抱子甘藍。這幾類除皺葉甘藍外，其他的在史料記載中均起源于歐洲西北部沿海地區(qū)。Ⅱ青花菜和花椰菜。起源于地中海沿岸。Ⅲ芥藍。首先作為一個單獨的類群聚出，表明其與前兩大類群的甘藍類植物在進化途徑上有所不同，推測其起源于中國南方。

在相似系數(shù)約為0.77處，13份芥藍材料可分為三類（圖2）。東升芥藍（38）是一高代自交系，聚為第一類。桃山中花（31）可葉、薹兼用，本地鐵種（32）為葉用芥藍，均表現(xiàn)為葉形橢圓、葉面平滑，聚為第二類。其余為第三類，這類材料除長葉中熟（35）葉形為橢圓外，其他材料特點是葉形寬卵圓，葉面皺縮；老種香菇（34）、長葉中熟為薹用類型，其中長葉中熟的主薹為紫紅色，側(cè)薹商品性好；日本綠（36）來自于日本，與老種香菇、長葉中熟的親緣關(guān)系較近；香港遲花（37）來自香港，與矮腳筷（33）的親緣關(guān)系較近。芥藍的植物學(xué)性狀見表2。

圖2 基于EST-SSR分析的38份甘藍類材料聚類樹狀圖

表2 芥藍植物學(xué)性狀調(diào)查結(jié)果

3 討論

本試驗將芥藍分為三類，除高代自交系東升芥藍獨為一類外，其他兩類與Okuda和Fujime（1996）根據(jù)植物學(xué)性狀的分類結(jié)果及Matsui等（2002）的RAPD分析結(jié)果基本一致，主要是根據(jù)葉形和葉面進行分類。

芥藍的起源現(xiàn)存有兩種觀點，一是中國南方起源說，在中國目前能追溯到的最早有關(guān)芥藍的記載是宋朝蘇東坡（1037～1101）的詩句“芥蘭如菌蕈，脆美牙頰響”，距今已有 900多年的歷史；而《中國蔬菜栽培學(xué)》（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，1987）記載最早引進中國的結(jié)球甘藍和花椰菜，也只有300余年的歷史，說明芥藍可能原產(chǎn)于中國；張平真（2009）綜合了各種史學(xué)資料認為芥藍為甘藍的一個變種，并支持芥藍起源于中國南方的說法。二是地中海沿岸地區(qū)起源說，支持這一學(xué)說代表著作有《植物學(xué)》（中山大學(xué)和南京大學(xué)，1984）和《中國的蔬菜》（章厚樸，1988）。本試驗中芥藍首先作為一個單獨的類群與其他甘藍類作物分開，表明芥藍與其他甘藍類作物可能是由不同路線進化而來。野生甘藍、觀賞羽衣甘藍、皺葉甘藍、結(jié)球甘藍、紫甘藍、苤藍、抱子甘藍起源于歐洲西北部沿海地區(qū)；青花菜和花椰菜起源于地中海沿岸；芥藍獨立于歐洲西北部類群和地中海沿岸類群，推測其可能起源于中國。有記載早在公元前5、6世紀，一種被稱為“西土藍”的甘藍類作物傳入中國（張平真，2006），在我國副熱帶氣候條件下，逐漸選育形成芥藍；Song等（1988）的 RFLP研究中芥藍為單獨一類，與千頭羽衣甘藍親緣關(guān)系較近，被認為是一種較為原始的類型，可能起源于一種由西歐傳到東亞的原始羽衣甘藍；本試驗中芥藍作為一個單獨的類群首先聚出，與其他甘藍材料的親緣關(guān)系較遠，可能是芥藍進化形成時間較早，且進化形成的地域與其他甘藍類作物隔離，支持芥藍起源于中國的說法。本試驗中選用的野生甘藍都屬于Brassica oleracea，全部來自英國，均聚于歐洲西北部沿海類群，表明羽衣甘藍、皺葉甘藍、結(jié)球甘藍、紫甘藍、苤藍、抱子甘藍可能都起源于野生甘藍（Brassica oleracea）；而至于芥藍的祖先，還需進一步收集范圍更廣的野生甘藍和近緣野生二倍體進行分析。

陳琛，莊木，李康寧，劉玉梅，楊麗梅，張揚勇，程斐，孫培田，方智遠.2010.甘藍EST-SSR標記的開發(fā)與應(yīng)用.園藝學(xué)報，37（2）：211-228.

陳全求，詹先進，藍家樣，黃云.2008.EST分子標記開發(fā)研究進展.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)科學(xué)，24（9）：72-77.

李錫香，方智遠.2008.芥藍種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社.

秦耀國，楊翠芹，曹必好，陳國菊，雷建軍.2009.芥藍遺傳育種與生物技術(shù)研究進展.中國農(nóng)學(xué)通報，25（18）：296-299.

章厚樸.1988.中國的蔬菜.北京：人民出版社.

張平真.2006.中國蔬菜名稱考釋：甘藍類蔬菜.北京：北京燕山出版社.

張平真.2009.關(guān)于芥藍起源的研究.中國蔬菜，（14）：62-65.

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所.1987.中國蔬菜栽培學(xué).北京：農(nóng)業(yè)出版社.

中山大學(xué)，南京大學(xué).1984.植物學(xué).北京：人民教育出版社.

周禹，李燕，孫勃，石瑜，汪俏梅，汪炳良.2010.芥藍與甘藍其他變種分類關(guān)系的研究.園藝學(xué)報，37（7）：1161-1168.

Boswell V R.1949.Our vegetable travelers.Natl Geogr Mag，96：145-217.

Gupta P K，Rustgi S，Sharma S，Singh R，Kumar N，Balyan H S.2003.Transferable EST-SSR marker for the study of polymorphism and genetic diversity in bread wheat.Mor Gen Genomics，270：315-323.

Helm J.1963.Morphologisch-taxonomische Gliederung der kultursippen von Brassica oleracea.Kulturplfanzen，11：92-210.

Matsui T，Okuda N，Kosugi Y.2002.Classification of Chinese kale cultivars by RAPD analysis.Journal of the Japanese Society for Horticultural Science，71（4）：499-503.

Okuda N，F(xiàn)ujime Y.1996.Plant growth characters of Chinese kale （Brassica oleracea L. var. alboglabra）.Acta Horticulturae，407：55-59.

Panda S，Martin J P，Aguinagalde I.2003.Chloroplast and nuclear DNA studies in a few members of the Brassica oleracea L. group using PCR-RFLP and ISSR-PCR markers：a population genetic analysis.Theor Appl Genet，106（6）：1122-1128.

Powell W，Machray G C，Provan J.1996.Polymorphism revealed by simple sequence repeats.Trends Plant Sci，7（2）：215-222.

Song K M，Osborn T C，Williams pH.1988.Brassica taxonomy based on nuclear restriction fragment length polymorphisms（RFLPs）.1.Genome evolution of diploid and amphidiploid species.Theor Appl Genet，75：784-794.

Thompson K E.1976.Cabbage，kale，etc//Simmonds N W.Evolution of crop plants.New York：Longman：49-52.