吳必武

(云南省保山疫苗廠，云南 保山 678000)

口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)感染引起的偶蹄動物共患的一種急性、烈性、接觸性傳染病。口蹄疫病毒對酸堿都特別敏感，在pH 7.2～7.6時穩(wěn)定性較強;在低溫下十分穩(wěn)定，但對熱敏感;經(jīng)紫外線照射后，其病毒RNA的尿嘧啶形成二聚物，致使FMDV迅速被滅活;電離輻射也可使病毒滅活;FMDV不含有囊膜，所以對脂溶劑(氯仿、丙酮等)有抵抗力。目前控制和撲滅口蹄疫最有效和最經(jīng)濟的手段是接種安全有效的疫苗。我國主要應(yīng)用于預(yù)防接種的是常規(guī)(細胞培養(yǎng))滅活疫苗。

在疫苗生產(chǎn)過程中消毒與滅菌的方法是否得當(dāng)，效果是否可靠，是疫苗生產(chǎn)能否順利進行的重要影響因素?，F(xiàn)對口蹄疫疫苗生產(chǎn)過程中消毒與消毒劑的應(yīng)用、種類及影響因素等方面進行探討，這對口蹄疫疫苗的規(guī)范生產(chǎn)和質(zhì)量控制具有實用意義。

1 口蹄疫疫苗生產(chǎn)過程常用消毒方法

為了保證細胞培養(yǎng)與病毒接種的正常進行，疫苗生產(chǎn)過程中所用的大量玻璃器皿、橡膠制品、各種溶液、金屬器械及潔凈工作服均需要消毒滅菌。其中無菌間等生產(chǎn)車間、人員手部以及各種金屬器械一般用化學(xué)方法或紫外線輻射進行消毒。

1.1 紫外線消毒

紫外線的殺菌波長范圍是265～268 nm，它可以引起DNA中形成胸腺嘧啶二聚體，干擾DNA復(fù)制，從而導(dǎo)致細菌變異或死亡。紫外線消毒對被消毒物品的損傷小，無殘留毒性，且經(jīng)濟方便，對設(shè)備要求不高，使用范圍廣，安全可靠，但紫外線的穿透能力弱，不能通過普通玻璃、塵埃，只能用于消毒物體表面、空氣及無菌操作室，也可用于不耐熱物品表面消毒。

1.1.1 對空氣消毒

對空氣消毒的最好方法之一是使用空氣過濾和紫外線照射相結(jié)合。一般每10～15 m2面積安裝30 W紫外線燈管1支，燈管安裝于距地面2.0～2.5 m高處，由于空氣能自由流動，所以一般都能得到消毒。在室溫20～40℃，相對濕度不高于60%時，照射30 min即可達到消毒要求。

1.1.2 對水的消毒

用紫外線消毒水的優(yōu)點是水中不必添加其它消毒劑或提高溫度。紫外線消毒水時，照射劑量要在90 000μW·s/cm2以上，且水層不宜超過2 cm。紫外線在水中穿透力，隨深度的增加而降低，如表1。

表1 蒸餾水深度對紫外線穿透的影響

1.1.3 對污染表面的消毒

在無菌間，紫外線等一般安裝在層流罩下，燈管功率不少于2W/m2，照射時間為30 min，消毒的有效范圍在1.5～2.0 m處，照射劑量要在10 000μW·s/cm2以上。在開始工作和工作完畢后，打開紫外燈，使工作臺面完全暴露，照射30 min，可達到消毒目的。使用時應(yīng)注意要保證足夠的輻射強度和足夠的照射時間，以確保消毒的效果。

1.2 化學(xué)消毒

消毒劑對一切細胞原生質(zhì)均有毒性，其作用機制有:使菌體蛋白凝固變性;干擾細菌酶的活性，抑制細菌代謝和生長;損害細胞膜的結(jié)構(gòu)，改變其通透性，破壞其生理功能等，從而起到消毒滅菌作用。生產(chǎn)車間常用的化學(xué)消毒劑有甲醛、氫氧化鈉、新潔爾滅、甲酚皂等。

1.2.1 對無菌間的消毒

每次使用無菌間后，必須用0.2%新潔爾滅溶液、5%甲酚皂溶液擦拭臺面及各種器皿，并用上述溶液擦拭地面。新潔爾滅溶液和甲酚皂溶液應(yīng)交替使用，以防細菌產(chǎn)生抗藥性。除此之外，還應(yīng)定期或不定期的用化學(xué)熏蒸法進行消毒，一般每月1次。對無菌間的熏蒸消毒一般采用甲醛熏蒸和過氧乙酸熏蒸，但這兩種方法所需熏蒸時間長，均在12～24 h，并且由于熏蒸后消毒劑殘留嚴重，對人體影響較大，消毒后無菌間不能立即使用，影響生產(chǎn)的正常進行，所以在疫苗生產(chǎn)中不常使用，只有在更換病毒血清型時才用。目前通常采用臭氧熏蒸法，該法具有殺菌消毒譜廣、殺菌消毒率高、殺毒速度快(比甲醛熏蒸縮短6倍)、安全無殘毒等優(yōu)點，在消毒完畢30 min后，人員即可進入，不影響正常生產(chǎn)。

根據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范》和實踐應(yīng)用數(shù)據(jù)，在GMP制藥車間的潔凈區(qū)，潔凈級別十萬級消毒需要保持臭氧濃度為10 mg/m3，萬級為30 mg/m3。在消毒過程中濕度要控制在70% ～80%，低于45%時消毒效果就會受到很大影響。

1.2.2 對物品的消毒

進入萬級潔凈區(qū)的物品，除用熱力滅菌之外，其余物品如血清瓶、消毒液等，均需用0.2%新潔爾滅或5%甲酚皂擦拭容器外壁消毒。病毒區(qū)使用過的細胞瓶在裝入滅菌柜之前要用4%NaOH 500 mL涮洗內(nèi)壁，凍破的病毒液瓶應(yīng)浸泡在4%NaOH中24 h以上。各種設(shè)備、金屬儀器如干燥箱、高壓柜、顯微鏡等應(yīng)定期用消毒液擦拭，一般每3天1次。在細胞的傳代過程中，操作人員的手每接觸一次細胞瓶口，都要用酒精棉球擦拭手及瓶口。

2 影響消毒效果的因素

各種消毒滅菌方法都有其影響因素，在使用過程中如不注意這些影響因素，就可能會對消毒效果產(chǎn)生直接影響。各種消毒滅菌方法的影響因素簡述如下:

2.1 影響熱力消毒和滅菌的因素

(1)微生物的種類和生存環(huán)境:不同種類的微生物或是同種但非同種株的微生物的熱耐受力是不一樣的。微生物的生存環(huán)境對其耐熱能力有很大影響。當(dāng)微生物生存在富含血清、蛋白質(zhì)、碳水化合物等物質(zhì)在內(nèi)的環(huán)境時，對熱的抵抗力將會增強。

(2)加熱時的環(huán)境:加熱時，微生物外環(huán)境中的氣壓、酸堿度、離子的濃度等都可影響消毒效果。

(3)被消毒物的種類和大小:不同種類的被消毒物品，其傳熱能力不同。金屬制品消毒時，一般15 min即可，而傳熱能力差的衣物等則要30 min。

2.2 影響過濾除菌的因素

影響過濾除菌效果的因素主要有過濾材料的結(jié)構(gòu)、特性、濾床的層次以及濾孔大小、纖維帶電的強弱等。一般濾器的孔徑小于0.5～5.0μm即可達到良好的除菌目的。濾床層次多、濾料纖維帶電強時，過濾除菌效果會增強。

2.3 影響紫外線消毒作用的因素

2.3.1 微生物自身的因素

(1)微生物的類型:不同微生物對紫外線照射的敏感性不同，對紫外線最為敏感的是革蘭氏陰性菌，其次為革蘭氏陽性菌，再次為芽孢。病毒也能被紫外線滅活。

(2)微生物的數(shù)量:微生物的數(shù)量越多，需要產(chǎn)生相同致死作用的紫外線照射劑量也就越大。

(3)生長期或芽生期的差別。

(4)懸浮的類型:枯草桿菌芽孢在灰塵中懸浮比在氣溶膠中懸浮時，對紫外線照射有更大的抗性。

2.3.2 有機物的影響

胨、蛋、牛奶，特別是血和血清的存在對紫外線的消毒效果有一定影響，當(dāng)有機物存在時，需延長消毒時間。

2.3.3 環(huán)境因素

(1)溫度的影響:大多數(shù)的微生物(除了耐輻射微球菌屬外)在低溫時對紫外線輻射很敏感。另外，環(huán)境溫度對紫外線燈的輸出強度也有影響，一般以室溫條件(27～40℃)輸出強度最大，環(huán)境溫度過高或過低都使輸出強度降低。

(2)濕度的影響:紫外線照射消毒時要求相對濕度在60%以下。

2.3.4 紫外線輻射波長的影響不同波長紫外線的殺菌力不同，如表2。

表2 不同波長紫外線殺菌力比較

2.4 影響化學(xué)消毒效果的因素

2.4.1 消毒劑方面的因素

(1)藥物的特異性:某些藥物只對某一部分微生物有抑制作用，而對另一些微生物則效力很差。

(2)藥物的濃度:消毒劑的消毒效果一般與其濃度成正比。

(3)消毒劑的物理狀態(tài):只有溶液才能進入微生物體內(nèi)，起到應(yīng)有的消毒效果。所以固體消毒劑必須溶于水中，氣體消毒劑必須溶于細菌周圍液層中，才有殺菌作用。

2.4.2 環(huán)境方面的因素

(1)溫度:一般消毒劑，當(dāng)溫度升高時，殺菌能力加強。

(2)濕度:每種氣體消毒劑都有其適宜的相對濕度。

(3)pH:酸堿度對細菌和消毒劑均有影響。pH改變時，細菌的電荷也發(fā)生改變。同時，pH值也影響消毒劑的電離度。

(4)有機物的存在:覆蓋于菌體表面的有機物，具有機械性保護作用。

(5)接觸時間:微生物與消毒劑接觸的時間愈久，死亡數(shù)目愈多，消毒效果越好。

2.4.3 微生物方面的因素

(1)微生物種類及其特性:不同種類的微生物對各類消毒劑的敏感性是不完全一樣的;細菌的繁殖體及其芽孢對化學(xué)藥物的抵抗力不同;生長期和靜止期的細菌對消毒劑的敏感程度亦有差別。

(2)微生物的數(shù)量:微生物的數(shù)量越多，所需消毒劑劑量就越大，需要作用的時間也越長。

3 結(jié)論

在疫苗生產(chǎn)過程中消毒與滅菌的方法是否得當(dāng)，效果是否可靠，是疫苗生產(chǎn)能否順利進行的重要影響因素。因此不斷的總結(jié)、研究疫苗生產(chǎn)過程的消毒方法、消毒劑類型對疫苗生產(chǎn)順利進行、疫苗質(zhì)量的提升將起到極大的促進作用。