黃華璠,周 浩,黃士堂,褚泰偉

(北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院放射化學(xué)與輻射化學(xué)重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室北京分子科學(xué)國家實(shí)驗(yàn)室,北京 100871)

99Tcm-BnAO作為一種非硝基咪唑類乏氧顯像劑,在臨床上具有乏氧顯像的應(yīng)用價(jià)值[1-4]。然而體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),99Tcm-BnAO的乏氧與正常細(xì)胞放射性攝取比偏低[5],動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,腫瘤與血的放射性攝取比也較低,達(dá)不到顯像的要求[6]。

本工作擬在配體BnAO的側(cè)鏈上進(jìn)行乙二醇獨(dú)甲醚的修飾,以期提高BnAO脂溶性,從而達(dá)到提高99Tcm-BnAO類顯像劑在腫瘤內(nèi)的攝取率,縮短顯像時(shí)間的目的。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器與裝置

自動(dòng)γ計(jì)數(shù)器:美國Parckard公司;99Mo-99Tcm發(fā)生器:原子高科股份有限公司;APEX IV傅里葉變換高分辨質(zhì)譜:美國Bruker公司;DY-W1型電泳儀:北京試驗(yàn)設(shè)備廠;核磁共振儀:400 MHz,美國Bruker公司。

1.2 主要材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純;99Tcm-BnAO藥盒:北京欣科思達(dá)醫(yī)藥科技有限公司;聚酰胺薄層板:浙江臺(tái)州市路橋四青生化材料廠。

1.3 動(dòng)物模型

雄性昆明小鼠:一級(jí),體重20～25 g,由中科院動(dòng)物所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供;S180細(xì)胞株:北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。在小鼠左腋下移植S180肉瘤,10 d后,腫瘤直徑約1.5 cm時(shí)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 BnAO-乙二醇獨(dú)甲醚的合成

BnAO及BnAO-乙二醇獨(dú)甲醚化學(xué)結(jié)構(gòu)示于圖1,BnAO-乙二醇獨(dú)甲醚的合成路線示于圖 2 。[7-8]

圖1 BnAO及BnAO-乙二醇獨(dú)甲醚的結(jié)構(gòu)

于150 mL乙醚中加入9.97 g 3-甲基-2-烯-1-丁醇,冷卻至-5℃。逐滴加入15 mL PBr3并保持溫度在0℃以下,電磁攪拌45 min。逐滴緩慢加入100 mL NaCl溶液淬滅反應(yīng)。分離出有機(jī)相,用Na2 SO4干燥,于常溫下減壓旋蒸,得到產(chǎn)物 1-溴-3-甲基-2-丁烯約 4.5 g,產(chǎn)率約80%。

圖2 BnAO-乙二醇獨(dú)甲醚的合成路線

2.4 mL乙二醇獨(dú)甲醚溶于 10 mL無水THF,逐份加入共 0.6 g NaH,于室溫?cái)嚢?5 min。再加入0.8 mL產(chǎn)物 1-溴-3-甲基-2-丁烯,室溫?cái)嚢? h。減壓蒸餾,殘留物溶于二氯甲烷。過濾溶液,用10 mL稀鹽水洗滌。分離出有機(jī)相,用MgSO4干燥,減壓蒸餾。殘留物用柱色譜純化,展開劑為V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=10∶1,得到產(chǎn)物1-(2-甲氧基乙氧基)-3-甲基-2-丁烯約0.5 g。產(chǎn)率約40%。

1 g 1-(2-甲氧基乙氧基)-3-甲基-2-丁烯和1.2 mL亞硝酸異戊酯用干冰丙酮浴冷卻至-30℃,劇烈攪拌均勻。在 1 h內(nèi)逐滴加入1 mL冷卻的1 mol/L HCl,再攪拌 2 h。整個(gè)過程中保持溫度＜-20℃。在低溫下真空抽濾反應(yīng)物,沉淀用10 mL冷乙醚洗滌,得到產(chǎn)物3-氯-1-(2-甲氧基乙氧基)-3-甲基-2-亞硝基丁烷約0.35 g,產(chǎn)率約25%。

于1.0 mL乙腈中加入0.3 mL二異丙基乙基胺,再加入200 mg 3-氯-1-(2-甲氧基乙氧基)-3-甲基-2-亞硝基丁烷以及40 mg 1,4-丁二胺。于室溫反應(yīng)17 h。過濾反應(yīng)物,用5 mL去離子水洗滌沉淀,用乙腈重結(jié)晶,得到最終產(chǎn)物BnAO-乙二醇獨(dú)甲醚約86 mg,產(chǎn)率約40%。

2.2 99Tcm-BnAO及99 Tcm-BnAO-乙二醇獨(dú)甲醚的制備

99Tcm-BnAO-乙二醇獨(dú)甲醚的制備:用0.1 mol/L碳酸氫鈉溶液作為緩沖溶液,加入50μg BnAO-乙二醇獨(dú)甲醚、25μg酒石酸鈉、1μg SnCl2、0.1 mL99TcmO4-,于 75 ℃下反應(yīng)10 min。薄層色譜法(TLC)檢測標(biāo)記率,聚酰胺薄層為載體,生理鹽水為展開劑,上行展開。

實(shí)驗(yàn)中的99Tcm-BnAO采用藥盒標(biāo)記,標(biāo)記率約為95%。將標(biāo)記產(chǎn)物于室溫下放置不同時(shí)間后,測定放化純度,考察標(biāo)記物的體外穩(wěn)定性。

2.3 電泳實(shí)驗(yàn)

稱取 0.68 g KH2PO4和 7.16 g Na2HPO4·12H2O溶于 500 mL去離子水中配制0.05 mol/L p H 7的電解液,倒入電解裝置。將99Tcm-BnAO及99Tcm-BnAO-乙二醇獨(dú)甲醚分別點(diǎn)樣于紙條中心,將紙條置于電解裝置上,用電解液潤濕,通200 V 恒壓電解30 min。取出紙條,迅速用電吹風(fēng)吹干,測量標(biāo)記物的分布。

2.4 脂水分配系數(shù)

在離心管中加入1 mL正辛醇、1 mL生理鹽水和10μL標(biāo)記產(chǎn)物,于渦旋混合器上劇烈震蕩3 min,使其充分混勻,然后離心5 min。各取10μL上層正辛醇和下層生理鹽水測定計(jì)數(shù)。平行3次實(shí)驗(yàn)。

2.5 生物分布

分別隨機(jī)選取5只荷S180瘤小鼠,經(jīng)尾靜脈注射0.1 mL(1 MBq)99Tcm-BnAO及99Tcm-BnAO-乙二醇獨(dú)甲醚標(biāo)記液 (放化純度大于90%),分別于注射后 0.5、1、2、4 、8 h 眼眶取血,斷頸處死,取出感興趣區(qū)的組織和器官,用水沖洗,拭干后稱重,計(jì)算每克組織器官中的放射性攝取率(%ID/g)。

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)構(gòu)表征

結(jié)構(gòu)鑒定:核磁共振1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ10.74(s,2H,C=N-OH),4.23(s,4H,NCH2),3.52(m,4H,NCH2OCH2),3.44(m,4H,CH 2OCH 3),3.24(s,6H,CH 2OCH 3),2.22(m,4H,-NHCH 2—),1.86(m,2H,-NHCH 2—),1.30(m,4H,-NHCH 2CH 2—),1.16(s,12H,C(CH 3)2)。高分辨質(zhì)譜(ESI)C20H43N4O6[M+H]+:m/z理論值為435.317 71,m/z測量值為435.316 73。上述結(jié)果表明所合成的產(chǎn)物為目標(biāo)產(chǎn)物。

3.2 標(biāo)記率及體外穩(wěn)定性

通過對標(biāo)記體系中p H、SnCl2用量、反應(yīng)溫度、中間絡(luò)合劑等條件進(jìn)行優(yōu)化后,所得99Tcm-BnAO-乙二醇獨(dú)甲醚標(biāo)記率大于90%。體系中各組分的Rf:99TcmO2·x H2O膠體,99TcmO4-及99Tcm與酒石酸鈉形成的配合物為0～0.3,99Tcm-BnAO-乙二醇獨(dú)甲醚為0.7～1.0。

標(biāo)記物于室溫下放置6 h后,放化純度仍大于90%?？梢姌?biāo)記產(chǎn)物體外穩(wěn)定性良好。通過脂水分配系數(shù)實(shí)驗(yàn)測得99Tcm-BnAO-乙二醇獨(dú)甲醚的分配系數(shù)為0.187±0.009,99Tcm-BnAO為0.165±0.012,通過修飾后標(biāo)記物的脂溶性有所提高。

3.3 電泳實(shí)驗(yàn)

99Tcm-BnAO和99Tcm-BnAO-乙二醇獨(dú)甲醚電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖3和圖4。圖3和圖4顯示,兩個(gè)標(biāo)記物的放射性主要集中在原點(diǎn),向陽極或陰極遷移非常小。此結(jié)果表明,99Tcm-BnAO和99Tcm-BnAO-乙二醇獨(dú)甲醚為電中性,有利于進(jìn)行乏氧顯像。

3.4 荷S180瘤小鼠體內(nèi)生物分布

圖3 99 Tcm-BnAO電泳分布圖

99Tcm-BnAO及99Tcm-BnAO-乙二醇獨(dú)甲醚在荷S180肉瘤小鼠體內(nèi)的生物分布分別列于表1和表2。對比表2和表1可知,經(jīng)過乙二醇獨(dú)甲醚修飾后,標(biāo)記物水溶性仍很大,在注射30 min后這兩個(gè)標(biāo)記物血液清除都很快。心、肺、胃和肌肉在開始有少量攝取,但很快清除。腦中則幾乎無攝取。隨著時(shí)間延長,99Tcm-BnAO及99Tcm-BnAO-乙二醇獨(dú)甲醚在腫瘤組織的相對攝取量逐漸增加。99Tcm-BnAO-乙二醇獨(dú)甲醚的腫瘤與血、腫瘤與肌肉放射性攝取比(T/NT)較99Tcm-BnAO有所降低。

圖4 99 Tcm-BnAO-乙二醇獨(dú)甲醚電泳分布圖

表1 99 Tcm-BnAO在荷S180瘤小鼠體內(nèi)的放射性攝取率(,n=5)

表1 99 Tcm-BnAO在荷S180瘤小鼠體內(nèi)的放射性攝取率(,n=5)

器官 不同時(shí)間的放射性攝取率/(%ID·g-1)0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h血液 1.69±0.32 0.79±0.47 0.55±0.19 0.35±0.17 0.47±0.14心1.54±0.17 0.69±0.23 0.49±0.13 0.34±0.06 0.26±0.02肺2.36±0.11 1.39±0.39 1.21±0.25 0.96±0.19 0.78±0.12肝 10.70±1.01 8.21±1.49 8.02±1.69 7.50±1.34 4.66±0.39脾2.58±0.46 1.63±0.52 1.50±0.25 1.37±0.28 0.93±0.11胃2.18±0.39 1.40±0.49 0.96±0.28 0.91±0.35 0.55±0.04腎4.06±0.68 2.07±0.62 1.83±0.59 1.15±0.18 0.80±0.17肌肉 1.22±0.24 0.49±0.19 0.24±0.06 0.20±0.03 0.14±0.02骨頭 1.04±0.42 0.51±0.18 0.40±0.10 0.30±0.05 0.25±0.06腦0.31±0.03 0.23±0.07 0.15±0.03 0.11±0.02 0.09±0.00腫瘤 1.60±0.35 1.18±0.33 1.03±0.12 0.77±0.27 0.61±0.13小腸 3.66±0.92 4.92±2.18 3.26±1.22 1.69±0.22 0.67±0.04

表2 99 Tcm-BnAO在荷S180瘤小鼠體內(nèi)的放射性攝取比,n=5)

表2 99 Tcm-BnAO在荷S180瘤小鼠體內(nèi)的放射性攝取比,n=5)

器官T/NT 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h腫瘤與血液 0.94±0.14 1.67±0.44 2.05±0.66 2.40±1.04 1.35±0.24腫瘤與肌肉 1.36±0.47 2.54±0.53 4.44±1.04 3.94±1.25 4.44±0.92

表3 99 Tcm-BnAO-乙二醇獨(dú)甲醚在荷S180瘤小鼠體內(nèi)放射性攝取率,n=5)

表3 99 Tcm-BnAO-乙二醇獨(dú)甲醚在荷S180瘤小鼠體內(nèi)放射性攝取率,n=5)

器官不同時(shí)間的放射性攝取率/(%ID·g-1)0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h血液 1.19±0.21 1.12±0.63 0.58±0.11 0.40±0.09 0.23±0.15心0.78±0.02 0.77±0.39 0.35±0.01 0.28±0.02 0.24±0.04肺1.03±0.06 0.97±0.46 0.56±0.06 0.47±0.03 0.40±0.09肝5.13±1.50 5.10±2.50 2.93±0.60 2.61±0.66 1.93±1.01脾0.96±0.06 0.81±0.38 0.55±0.08 0.40±0.04 0.31±0.07胃1.69±0.28 1.53±0.91 1.74±0.79 1.37±0.37 1.04±0.16腎2.61±0.30 2.17±1.04 1.21±0.14 0.99±0.07 0.88±0.25肌肉 0.71±0.09 0.55±0.29 0.24±0.12 0.15±0.01 0.14±0.02骨頭 0.67±0.06 0.58±0.21 0.39±0.09 0.35±0.05 0.28±0.04腦0.11±0.01 0.10±0.03 0.07±0.00 0.05±0.00 0.05±0.01腫瘤 1.03±0.06 0.85±0.37 0.60±0.07 0.41±0.19 0.44±0.04小腸 4.84±0.89 2.48±1.10 1.78±1.03 1.03±0.27 0.66±0.29

表4 99 Tcm-BnAO-乙二醇獨(dú)甲醚在荷S180瘤小鼠體內(nèi)的放射性攝取比(,n=5)

表4 99 Tcm-BnAO-乙二醇獨(dú)甲醚在荷S180瘤小鼠體內(nèi)的放射性攝取比(,n=5)

器官T/NT 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h腫瘤與血液 0.90±0.23 0.80±0.13 1.06±0.28 1.05±0.51 1.27±0.12腫瘤與肌肉 1.47±0.21 1.65±0.40 2.76±0.76 2.71±1.16 3.21±0.24

4 結(jié) 論

99Tcm-BnAO作為乏氧顯像劑在臨床上具有一定的腫瘤乏氧診斷的應(yīng)用價(jià)值,但是仍存在一些不足。本工作在配體BnAO的側(cè)鏈上進(jìn)行乙二醇獨(dú)甲醚的修飾,希望適當(dāng)改變脂溶性,但是通過生物分布實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)實(shí)際效果并不明顯。因此,要改善99Tcm-BnAO類乏氧顯像劑的性能,還需要大量的研究。

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