梁靚靚，陳蘇寧，王曉鳳，蔡玉文

調(diào)氣消積湯對(duì)Lewis肺腫瘤小鼠抑瘤作用及細(xì)胞凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究*

梁靚靚1，陳蘇寧1，王曉鳳1，蔡玉文2

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院中醫(yī)科，沈陽 110004；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，沈陽 110032）

[目的]探討調(diào)氣消積湯對(duì)Lewis肺腫瘤的抑瘤作用及細(xì)胞凋亡的影響。[方法]C57BL/6小鼠常規(guī)接種Lewis肺腫瘤，隨機(jī)分為：荷瘤對(duì)照組（MG）、調(diào)氣消積湯組（TG）、順鉑組（DG）、綜合組（ZG），每組10只。每天分別予飲用水、調(diào)氣消積湯各0.4mL灌胃，共12 d；隔日1次腹腔注射生理鹽水、順鉑0.13mL共3 d。觀察其日常生活狀況和腫瘤生長情況，應(yīng)用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（TUNEL）檢測(cè)調(diào)氣消積湯對(duì)Lewis肺腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。[結(jié)果]調(diào)氣消積湯能改善Lewis肺腫瘤小鼠一般狀況，與荷瘤對(duì)照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。各治療組的瘤質(zhì)量均低于荷瘤對(duì)照組，差異顯著（P<0.01）。光鏡下觀察，各治療組與荷瘤對(duì)照組比較，異型細(xì)胞較少，染色質(zhì)濃縮邊集，病理性核分裂較少。TUNEL法結(jié)果顯示，各治療組與荷瘤對(duì)照組相比凋亡細(xì)胞明顯增多，綠色熒光強(qiáng)度高；尤以綜合組增多最為明顯。[結(jié)論]調(diào)氣消積湯可以改善荷瘤小鼠的一般生活狀況，對(duì)Lewis肺腫瘤有抑制作用，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

調(diào)氣消積湯；Lewis肺腫瘤；細(xì)胞凋亡

調(diào)氣消積湯是在小柴胡湯原方基礎(chǔ)上加味而來的臨床治療肺腫瘤的有效方劑。本實(shí)驗(yàn)通過觀察各組荷瘤小鼠的一般狀態(tài)、腫瘤的生長情況、腫瘤組織在光鏡下結(jié)構(gòu)的改變以及細(xì)胞凋亡的情況，來探討調(diào)氣消積湯的抑癌作用及其機(jī)制，并客觀地評(píng)價(jià)其抗腫瘤效應(yīng)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 1）調(diào)氣消積湯由柴胡10 g，黃芩15 g，人參 10 g，半夏 15 g，炙甘草 10 g，生姜 10 g，大棗 4 枚（10g），天門冬 15g，生牡蠣 30g，莪術(shù) 15 g，白花蛇舌草20 g等組成。購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥局，按照中藥常規(guī)煎法煎成相當(dāng)于生藥1×10-3g/mL，4℃冰箱保存，用前稀釋至所需濃度。2）注射用順鉑（DDP），每支 10mg，齊魯制藥(海南)有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H20073652。每日給藥前用蒸餾水配制成1 g/L藥液。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與瘤株 近交系C57BL/6J小鼠50只，鼠齡 10周，體質(zhì)量（20±2）g，均為雌性，動(dòng)物級(jí)別：清潔級(jí)，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，許可證編號(hào)：SC XK（京）2004-0001。Lewis肺腫瘤細(xì)胞株，由中國醫(yī)科大學(xué)免疫實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 錐蟲藍(lán)染色液，20%烏拉坦注射液，4%多聚甲醛溶液，0.08%多聚賴氨酸（Sigm a公司），原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展公司）等。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 高速離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司，TG-W S）；小鼠自主活動(dòng)測(cè)試儀（成都泰盟科技有限公司，ZZ－6）；包埋機(jī)（EG 1150H）、手動(dòng)石蠟切片機(jī)（RM 2235）、攤片機(jī)（HI 1150）、烘片機(jī)（HI 1220）、智能化組織脫水機(jī)（LEICA ASP 300）（德國萊卡公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模[1]-100℃液氮保存的Lewis瘤株，于37℃水浴中復(fù)蘇，然后接種于C57BL/6小鼠腹腔；9 d后，無菌條件下操作，取荷瘤小鼠腹水，經(jīng)生理鹽水洗滌后，調(diào)整細(xì)胞濃度至約2×109個(gè)/L的瘤細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色觀察記錄活細(xì)胞數(shù)（＞95%）；在每只小鼠右腋窩皮下接種瘤細(xì)胞0.2mL，共接種48只。

2.2 分組及給藥 接種5 d后，待移植瘤長至直徑0.3～0.5 cm時(shí)，選取荷瘤成功的小鼠40只，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為荷瘤對(duì)照組（MG）、調(diào)氣消積湯組（TG）、順鉑組（DG）、綜合組（調(diào)氣消積湯＋順鉑組）（ZG），每組10只。各組均在接種5 d后晨起空腹開始給藥。根據(jù)人和鼠給藥劑量換算公式[2]：dB=dA×RB/RA×（WA/WB）1/3，計(jì)算出給藥量。

1）灌胃每日1次，連續(xù)12 d。TG組和ZG組分別予相當(dāng)于含生藥16.5g/（kg·d）的調(diào)氣消積湯0.4mL；MG、DG組分別予飲用水0.4mL。

2）腹腔注射隔日1次，共3 d。DG和ZG組予順鉑注射液0.13mL；MG、TG組分別予生理鹽水0.13mL。

2.3 實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)

2.3.1 Lewis肺腫瘤小鼠生活狀況的評(píng)價(jià) 分別在實(shí)驗(yàn)的第1、4、7、12天記錄各組小鼠體質(zhì)量及平均進(jìn)食量，觀察小鼠一般狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前用ZZ-6型小鼠自主活動(dòng)測(cè)試儀，檢測(cè)各組小鼠在5min內(nèi)的自主活動(dòng)次數(shù)和站立次數(shù)。

2.3.2 Lewis肺腫瘤移植瘤質(zhì)量及腫瘤抑制率的比較 在電子天平上稱取瘤質(zhì)量。療效評(píng)價(jià)公式：抑瘤率＝（模型組平均瘤質(zhì)量－實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量）/模型組平均瘤質(zhì)量×100%。

2.3.3 Lewis肺腫瘤組織的病理形態(tài)學(xué)觀察 采用蘇木精—伊紅（HE）染色法。石蠟組織塊制作：取材和固定，修塊，沖洗，脫水，透明，浸蠟，包埋。石蠟切片制作：修切蠟塊，防脫片處理，切片，展片，撈片。HE染色：脫蠟，復(fù)水，染色，脫水，透明，封藏，用顯微鏡觀察染色結(jié)果：細(xì)胞核呈鮮艷的藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間質(zhì)呈粉紅至紅色。

2.3.4 TUNEL法檢測(cè)Lewis肺癌細(xì)胞凋亡 常規(guī)制作腫瘤組織石蠟切片。脫蠟及水合，加入蛋白酶K工作液，37℃反應(yīng)30min。每個(gè)預(yù)處理好的樣本滴加50μL脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移（TdT）酶反應(yīng)液，加蓋玻片37℃避光濕潤反應(yīng)60min（陰性對(duì)照不加TdT酶）。用激光共聚焦顯微鏡觀察，拍照。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用方差分析（One－Way ANOVA），方差齊時(shí)選用LSD法，方差不齊時(shí)選Dunnett’s T3療法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 調(diào)氣消積湯對(duì)Lewis肺腫瘤小鼠生活狀況的影響 實(shí)驗(yàn)第10天，在實(shí)驗(yàn)條件均一，無人為操作失誤的情況下，順鉑組有1只小鼠死亡，其余各組無死亡小鼠。實(shí)驗(yàn)過程中，各組小鼠一般生活狀況及進(jìn)食量詳見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，記錄各組小鼠在5min內(nèi)的自主活動(dòng)次數(shù)和站立次數(shù)，其中調(diào)氣消積湯組明顯高于荷瘤對(duì)照組、順鉑組、綜合組（P＜0.05，P＜0.01）。順鉑組基本喪失站立能力，表現(xiàn)最差。見圖1。

表1 各組一般狀況的比較（±s）Tab.1 The generalstatusofm ice in each group（±s）

表1 各組一般狀況的比較（±s）Tab.1 The generalstatusofm ice in each group（±s）

注：與荷瘤對(duì)照組比較，*P＜0.05。

數(shù)量 反應(yīng)性 體毛 大便 平均進(jìn)食量（g）荷瘤對(duì)照組 0 遲鈍 干枯，無光澤 變軟 2.03±0.75調(diào)氣消積湯組 0 較靈敏 柔順，有光澤 成形 2.85±0.28*順鉑組 1 非常遲鈍 稀疏脫落，無光澤 溏便 1.10±0.22*綜合組 0 遲鈍 少量脫落，無光澤 稀糊狀 1.37±0.36組別 死亡

3.2 調(diào)氣消積湯對(duì)Lewis肺腫瘤移植瘤質(zhì)量的影響 見表2。

由表2可以看出，各治療組的瘤質(zhì)量均低于荷瘤對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明調(diào)氣消積湯具有抑制腫瘤生長的作用；其中綜合組的抑瘤作用最強(qiáng)，抑瘤率為75.19%，順鉑組的抑瘤率為71.23%，調(diào)氣消積湯組的抑瘤率為29.37%。

表2 各實(shí)驗(yàn)組瘤質(zhì)量及抑瘤率的比（±s）Tab.2 Com parison of tumor weightand tumor inhibitory rate in each group（±s）

表2 各實(shí)驗(yàn)組瘤質(zhì)量及抑瘤率的比（±s）Tab.2 Com parison of tumor weightand tumor inhibitory rate in each group（±s）

注：與荷瘤對(duì)照組比較，**P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)量（n） 瘤質(zhì)量（g） 抑瘤率（%）始 末荷瘤對(duì)照組 10 10 1.161±0.156 -調(diào)氣消積湯組 10 10 0.820±0.116** 29.37順鉑組 10 9 0.334±0.089** 71.23綜合組 10 10 0.288±0.076** 75.19

3.3 調(diào)氣消積湯對(duì)Lewis肺癌組織病理形態(tài)學(xué)改變的影響 荷瘤對(duì)照組：肉眼可見腫瘤體積較大，形態(tài)不規(guī)則，質(zhì)脆易破，切開后極少見腫瘤組織壞死。低倍鏡下可見荷瘤對(duì)照組腫瘤細(xì)胞呈巢狀分布且生長旺盛，細(xì)胞密集排列。高倍鏡下可見腫瘤細(xì)胞密集排列，細(xì)胞大小不一，形狀不規(guī)則，細(xì)胞核肥大、畸形，染色深，核染色分布不均勻，病理性核分裂相多見，異型性明顯；腫瘤組織間質(zhì)中少見淋巴細(xì)胞浸潤。

調(diào)氣消積湯組：肉眼可見腫瘤體積較荷瘤對(duì)照組略小，形態(tài)不規(guī)則，腫瘤切開時(shí)可見部分壞死。鏡下可見腫瘤細(xì)胞仍密集排列，但細(xì)胞密度較荷瘤對(duì)照組有所減低，染色質(zhì)濃縮邊集，病理性核分裂相減少，異型細(xì)胞較少；部分瘤組織破壞，腫瘤組織間質(zhì)可見多少不等的炎細(xì)胞浸潤。

順鉑組：肉眼可見腫瘤體積較荷瘤對(duì)照組明顯減小，形態(tài)不規(guī)則，個(gè)別標(biāo)本瘤體不完整，腫瘤切開時(shí)多見壞死組織。鏡下可見腫瘤細(xì)胞密度明顯減低，多有腫脹、變性，病理性核分裂相明顯減少，異型細(xì)胞明顯減少；腫瘤組織內(nèi)見大片壞死，腫瘤組織間質(zhì)見較多炎細(xì)胞浸潤。

綜合組：肉眼可見腫瘤體積較荷瘤對(duì)照組明顯減小，形態(tài)不規(guī)則，個(gè)別標(biāo)本瘤體不完整，腫瘤切開時(shí)多見壞死組織。鏡下可見腫瘤細(xì)胞密度明顯減低，多有腫脹、變性，病理性核分裂相明顯減少，異型細(xì)胞明顯減少；腫瘤組織內(nèi)見大片壞死，壞死殘留的腫瘤細(xì)胞周圍有大量淋巴細(xì)胞和白細(xì)胞浸潤。

3.4 Tunel原位法檢測(cè)Lewis肺腫瘤細(xì)胞凋亡 在激光共聚焦顯微鏡下觀察Lewis肺腫瘤移植瘤細(xì)胞的凋亡，正常的活細(xì)胞不著色，凋亡的細(xì)胞呈綠色熒光。結(jié)果顯示荷瘤對(duì)照組異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的肺腫瘤細(xì)胞低染，少見凋亡形態(tài)的細(xì)胞。調(diào)氣消積湯組、順鉑組及綜合組的肺腫瘤細(xì)胞均高染，呈綠色熒光，表明各治療組移植瘤出現(xiàn)了大量凋亡的肺腫瘤細(xì)胞，其中綜合組綠色熒光強(qiáng)度最大。

4 討論

中醫(yī)藥治療惡性腫瘤著眼于“治病求本”的原則，與手術(shù)、放療、化療等局部殺滅方法最大的不同是強(qiáng)調(diào)整體調(diào)節(jié)，多方入手及全身治療，通過中藥復(fù)方中多種成分，多層次、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)綜合調(diào)節(jié)而發(fā)揮作用。

從多年的臨床實(shí)踐中體會(huì)到，晚期肺腫瘤患者，由于氣機(jī)紊亂，升降失常導(dǎo)致的癥狀較多，因此重視升降辨證，調(diào)整氣機(jī)的升降紊亂，采用“和法”調(diào)節(jié)肝氣，使用柴胡劑化裁治療晚期肺腫瘤，取得了較好的療效[3]。針對(duì)肺腫瘤的致病特點(diǎn)，篩選有效藥物立法組方而成的調(diào)氣消積湯是在小柴胡湯原方基礎(chǔ)上加味而來，在治療中重視升降理論的應(yīng)用，注重人體氣機(jī)運(yùn)動(dòng)的調(diào)暢，是臨床治療肺腫瘤的有效方劑。方中柴胡輕清升散、宣透疏解，既可向外以解表，又能向上以升陽，還可疏泄肝膽，肝膽疏則氣行有序，升降出入?yún)f(xié)調(diào)平衡；黃芩苦寒，長于清泄肺熱，與柴胡合用可疏解少陽郁滯之邪熱，使氣機(jī)通達(dá)，樞機(jī)調(diào)和，兩者共為方中君藥；生牡蠣重鎮(zhèn)安神，軟堅(jiān)散結(jié)；白花蛇舌草、莪術(shù)清熱解毒、活血化瘀，三藥共為臣藥；生姜、半夏和胃止嘔，燥濕化痰，辛開散結(jié)，能開能降為佐藥；人參、天門冬、甘草、大棗為使，益氣養(yǎng)陰潤肺，補(bǔ)益脾胃，調(diào)氣和中，具有增強(qiáng)中焦樞轉(zhuǎn)氣機(jī)，調(diào)和方中諸藥的作用。全方配伍升中有降，散中有收，調(diào)氣機(jī)，補(bǔ)肺氣，軟堅(jiān)散結(jié)，活血化瘀，共奏調(diào)暢氣機(jī)，抗肺腫瘤之效。

通過本實(shí)驗(yàn)可以看出，與荷瘤對(duì)照組比，經(jīng)調(diào)氣消積湯治療后的荷瘤小鼠，進(jìn)食量增加，一般生活狀況改善，5min自主活動(dòng)及站立次數(shù)增加，并抑制腫瘤的生長，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。順鉑組荷瘤小鼠的一般狀況最差，反應(yīng)非常遲鈍，基本喪失了站立的能力；而且在實(shí)驗(yàn)條件均一，無人為操作失誤的情況下，有1只小鼠死亡，由此可以看出，雖然化療藥物抗腫瘤的能力較強(qiáng)，但是同時(shí)也損傷了正常細(xì)胞，對(duì)荷瘤小鼠的全身都有損害，有很強(qiáng)的毒副作用。綜合組荷瘤小鼠的一般生活狀況較順鉑組改善，且抑瘤率最高。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，調(diào)氣消積湯可以改善Lewis小鼠的一般狀況，對(duì)肺腫瘤細(xì)胞的生長有抑制作用；與化療藥物合用可以提高療效，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，減輕化療毒副反應(yīng)，從而提高荷瘤小鼠的生存質(zhì)量。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡過程，是細(xì)胞衰老自然死亡的主要方式之一。在生物化學(xué)變化方面，凋亡的一個(gè)顯著的特征就是細(xì)胞染色質(zhì)DNA的降解。TUNEL法是1993年Wijsman等[4]提出的細(xì)胞凋亡的原位檢測(cè)法，是一種將分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法。該方法靈敏度高，可以特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞，凋亡細(xì)胞產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度比非凋亡細(xì)胞高數(shù)十倍，測(cè)定凋亡細(xì)胞的靈敏度要比壞死細(xì)胞高10倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示荷瘤對(duì)照組FITC標(biāo)記的肺腫瘤細(xì)胞低染，少見凋亡形態(tài)的細(xì)胞。調(diào)氣消積湯組、順鉑組及綜合組的肺腫瘤細(xì)胞均高染，呈綠色熒光，表明各治療組移植瘤出現(xiàn)了大量凋亡的肺腫瘤細(xì)胞，其中綜合組綠色熒光強(qiáng)度最大。實(shí)驗(yàn)證明了調(diào)氣消積湯抑制Lewis肺腫瘤細(xì)胞的作用，可能與促進(jìn)肺腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)；該方與化療藥物同用，可增強(qiáng)促肺腫瘤細(xì)胞凋亡的能力。

中醫(yī)藥治療腫瘤在治療的過程中更重視患者的主觀感受，有較好的改善癥狀、提高生存質(zhì)量和延長生存時(shí)間的作用，雖瘤體縮小不一定明顯，但通過穩(wěn)定瘤體、緩解癥狀使患者長期帶瘤生存。大量的實(shí)驗(yàn)證明，中西醫(yī)結(jié)合對(duì)惡性腫瘤的治療有著巨大的優(yōu)勢(shì)和潛力，其治療效果優(yōu)于單純的中醫(yī)和單純的西醫(yī)治療[5-6]。

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Effectsof the Tiaoqixiaojidecoction on anti-tumor and apoptosis inm icewith Lew is lung cancer

LIANG Jing-jing,CHENSu-ning,WANGXiao-feng,etal
(TCM department,Shengjing Hospital Affiliated to ChineseMedicalUniversity,Shenyang110004,China)

[Objective]Toexplore the therapeutic effectof Tiaoqixiaoji(TQXJ)decoction on anti-tumoreffectand apoptosisof Lewis lung cancer-bearingmice.[Methods]C57BL/6micewere inoculated with Lewis lung cancer cells routinely.Then theywere random ly divided into:modelgroup(MG),TQXJgroup(TG),DDP(Cisplatin)group(DG)and TQXJ-DDPgroup(ZG),with 10mice in each group.Different drugswere given to each group in order to observe the daily life and the tumorgrowing statusof themice.Determination of the cellapoptosis in the tumorous tissuewas performed by TUNELmethod.[Results]The generalstatusof the Lewis tumor-bearingmice could be improved by TQXJDecoction comparedwith MGgroup(P<0.01).The tumorweightofeach treatmentgroupwas lighter than theMG(P<0.01).Therewere some cellmorphological changes of the TG,DG and ZG,including the chromatin condensed inmargin and the pathological karyokinesis reduced obviously compared with the MG.In situ TUNEL assay showed that increased apoptotic cells could be seen in all treatmentgroups;the green fluorescence intensitywashigh and the ZGwashighest.[Conclusion]TQXJDecoction iseffective in improving the general life statusof tumor-bearingmice，and it can inhibit the growth of the Lewis lung cancer,and also can induce the apoptosis of the Lewis lung cancer cells.

Tiaoqixiaojidecoction;Lewis lung cancer;apoptosis

梁靚靚（1971-），女，博士，講師，主治醫(yī)師，1995年畢業(yè)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)療系，2010年獲得該校中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)專業(yè)博士學(xué)位，主要從事惡性腫瘤的中醫(yī)藥基礎(chǔ)與臨床研究，曾于1999—2003年在阿聯(lián)酋Modern Ployclinic工作4年，目前在中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院中醫(yī)科工作；近年來共發(fā)表學(xué)術(shù)論文20余篇，參與省、市級(jí)課題3項(xiàng)，博士畢業(yè)論文獲遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院優(yōu)秀畢業(yè)論文，現(xiàn)擔(dān)任遼寧省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)腫瘤專業(yè)、血液病專業(yè)委員會(huì)委員。

R734.2

A

1672-1519(2011)04-0277-04

2011-01-16）