王亞紅,張仰眉,肖 凱

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)醫(yī)院藥劑處,呼和浩特 010017;2.第二軍醫(yī)大學海醫(yī)系毒物藥物研究室,上海 200433)

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bge.)的干燥根及根莖,是我國的傳統(tǒng)中藥。丹參始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,味苦、微寒,入心、心包及肝經(jīng),具有活血通絡、祛瘀止痛、涼血消癰、清心除煩等功效[1]。丹參的脂溶性成分為二萜醌類化合物,丹參酮及單體都具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、改善心肌缺血等藥理作用,廣泛應用于治療心血管病的中成藥制劑,對治療冠心病、心絞痛、心動過速有顯著療效。丹參酮的提取一般選擇滲漉法或回流提取,在回收溶劑、濃縮、干燥過程中丹參酮損失嚴重,資源浪費較大。超臨界CO2萃取是以超臨界狀態(tài)下的CO2流體為溶劑來提取分離混合物的過程。超臨界流體兼具氣體和液體的雙重特性,具有很強的溶解能力,良好的流動性和傳遞性。超臨界CO2萃取通過調(diào)節(jié)超臨界CO2流體的壓力和溫度來控制溶解度和蒸氣壓這兩個參數(shù),從而達到物質(zhì)分離的效果[2]。本研究采用超臨界CO2萃取結(jié)合柱層析法對丹參原藥材進行提取、分離和純化,以期為工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料和儀器

1.1 儀器 HA221-50超臨界CO2萃取儀(江蘇華安超臨界萃取有限公司);HPLC儀,包括510高壓恒流泵和2487雙波長檢測器(美國Waters公司);N2000色譜工作站(浙江智達信息工程有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海儀器廠);FA1004電子天平(上海天平儀器廠)。

1.2 試劑、藥品和藥材 丹參藥材購自河北省安國市,丹參酮ⅡA含量為0.235%,符合《中華人民共和國藥典》2010版一部要求[3];丹參酮ⅡA對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號110766-200315);乙醇(純度95%,食品級,國藥集團化學試劑有限公司);CO2(純度99.9%,食品級,上海蓋斯工業(yè)氣體有限公司);中性氧化鋁(100～200目,上海五四化學試劑廠);甲醇(一級色譜純,天津市四友精細化學品有限公司);無水乙醇、苯(分析純,天津化學試劑三廠);純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

2 方法和結(jié)果

2.1 萃取方法 取已粉碎的丹參藥材粗粉200 g,裝入萃取釜中,當萃取釜和分離釜的壓力和溫度都達到設定值后,加入夾帶劑乙醇,開始萃取,并記錄時間。固定CO2流速為 30 L/h,設定工藝參數(shù),靜態(tài)萃取45 min,動態(tài)萃取45 min。在分離釜出口處收集萃取液,量取體積。對萃取液減壓回收乙醇,真空干燥,得到萃取物粗品。

2.2 丹參酮ⅡA的含量測定

2.2.1 溶液的配制 (1)對照品儲備液:精密稱取丹參酮ⅡA對照品 10.2 mg,置50 ml棕色量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,得到濃度為0.204 mg/ml的對照品儲備液。取對照品儲備液適量,置50 ml棕色量瓶中,用甲醇定容,得到濃度為4.08 μ g/ml的丹參酮ⅡA對照品溶液。(2)供試品溶液:精密稱取干燥的萃取物粗品0.1 g置50 ml量瓶中,加適量甲醇超聲溶解,再用甲醇稀釋至刻度,用0.45 μ m微孔濾膜濾過,棄去初濾液,取續(xù)濾液0.1 ml置50 ml量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,即得供試品溶液。以甲醇作為陰性對照品溶液。

2.2.2 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm,5 μ m);流動相 :甲醇-水(75∶25);檢測波長:270 nm;流速 :1.0 ml/min;柱溫 :室溫 ;進樣量:10 μ l。在此色譜條件下,取對照品、陰性對照品和供試品溶液進樣測定,得到色譜圖見圖1。由圖1可見,色譜峰分離良好,達到定量要求。

圖1 丹參酮ⅡA的HPLC譜圖Figure 1 HPLC photograms of tanshinoneⅡA

2.2.3 線性關(guān)系的考察 精密吸取2.2.1項下的對照品儲備液適量,置50 ml棕色量瓶中,用甲醇定容,得到系列濃度為 1.02 、2.04、4.08、8.16、16.32、32.64 μ g/ml的丹參酮ⅡA對照品溶液,按2.2.2項下的色譜條件進樣測定,用外標法以峰面積定量。將峰面積(A)對濃度(c)進行線性回歸,得標準曲線方程:A=2.2204×10-7c+3.819 3×10-3,(r=0.999 8,n=5),表明丹參酮ⅡA在 1.02～ 32.64 μ g/ml范圍內(nèi),濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3 工藝優(yōu)化

2.3.1 萃取條件的選擇 根據(jù)預實驗結(jié)果確定影響萃取效果的4個主要因素:夾帶劑用量、萃取釜壓力、萃取釜溫度和分離釜溫度。每個因素設定3個水平進行L9(34)正交試驗,考察最佳萃取條件(見表1)。

2.3.2 正交試驗 將丹參藥材粗粉裝入萃取釜中,同時加入夾帶劑,按設定的工藝參數(shù)進行萃取。試驗安排及結(jié)果見表2,方差分析結(jié)果見表3。

正交試驗結(jié)果表明,影響超臨界CO2萃取丹參酮ⅡA的因素依次為A＞C＞B＞D,最佳工藝條件為A3B1C3D2,即夾帶劑乙醇用量為120 ml,萃取釜壓力為20 MPa,萃取溫度為50℃,分離溫度為35℃。在此條件下對工藝進行驗證,結(jié)果粗提物中丹參酮ⅡA的量為414.2 mg(n=3),質(zhì)量分數(shù)為3.84%。

表1 正交試驗的因素和水平設計Table 1 Design of factors and levels of orthogonal test

表2 正交試驗設計和結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Table3Results of variance analysis

2.4 分離純化 取超臨界CO2萃取得到的丹參酮ⅡA粗提取物30 g溶于20 ml苯中,加10 g中性氧化鋁拌和均勻,取12 ml混合物裝于中性氧化鋁層析柱(70 cm×4 cm,用中性氧化鋁250 g)上,用苯洗脫,待色帶完全展開后,將氧化鋁緩緩倒出,按其顏色分為紫紅色段、橙紅色段、墨綠色段和暗紅色段。將紫紅色段氧化鋁粉末再裝于層析柱上,進一步用苯洗脫,分段收集洗脫液。用丹參酮ⅡA對照品作為對照,采用薄層色譜對流份進行跟蹤檢測,收集富含丹參酮ⅡA的流份,減壓回收溶劑,用 20%(V/V)無水乙醇重結(jié)晶,靜置過夜,得到紅色針狀結(jié)晶。經(jīng)HPLC法測得晶體中丹參酮ⅡA的質(zhì)量分數(shù)為93.49%。

3 討 論

索氏提取法和乙醇浸提法提取丹參酮ⅡA的主要缺點是提取率低、雜質(zhì)較多、顏色較深,提取耗時長、損失大。索氏提取法和乙醇浸提法萃取物中丹參酮的含量分別為16.1%和 18.8%[4]。超臨界CO2萃取的粗提物中丹參酮ⅡA含量明顯提高,但離單體還有很大差距。粗提物經(jīng)柱層析分離后可以得到較高純度丹參酮ⅡA,層析得到的其他各段分離物的成分還有待進一步的研究確定。本研究結(jié)果顯示,用超臨界CO2萃取提取丹參酮ⅡA是可行的,與其他方法比較有一定的優(yōu)勢[5,6],僅用少量安全的常規(guī)溶劑乙醇作夾帶劑即可,并且生產(chǎn)周期短,提取效率高。本研究對于超臨界CO2萃取丹參酮的工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的指導意義。

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