劉罡一,賈晶瑩,劉海明,陸 川,張夢琪,余 琛*

(1.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院中心實驗室,上海 200031;2.上海醫(yī)藥臨床研究中心分析化學(xué)部,上海 200233)

1 儀器和試藥

1.1 儀器 3200 Qtrap串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Applied Biosystems公司);液相色譜儀:包括 SIL-20ACH T自動進(jìn)樣器、LC-20AD輸液泵、DGU-20A3在線脫氣儀(日本島津公司);CP225D分析天平(德國Sartorius公司);Mikro冷凍高速離心機(jī)(德國Hettich公司);Vortex-2渦旋混合器(美國Scientific Industries公司)。

1.2 藥品和試劑 加巴噴丁(純度≥98%,批號TRC-020031001,加拿大T RC公司),內(nèi)標(biāo)磺胺二甲異嘧啶(純度 99.7%,批號 1024X,美國Sigma公司);甲醇、乙腈、甲酸為色譜純;實驗用水為雙蒸水(上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院中心實驗室自制)。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 XBridge Phenyl(150 mm×

2.1 mm,5 μ m)色譜柱(美國 Waters公司);流動相:0.02%甲酸的乙腈溶液-0.02%甲酸的水溶液(15∶85),流速:0.3 ml/min,柱溫:室溫,進(jìn)樣量:5 μ l。

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源,正離子掃描;氣簾氣:30,碰撞氣:7,GS1:50,GS2:50,離子源電壓:5000 V,離子源溫度:550℃;多離子反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描分析,加巴噴丁和內(nèi)標(biāo)磺胺二甲異嘧啶離子對分別為m/z 172→154.1和m/z 279→124。數(shù)據(jù)采集與處理采用Analyst 1.4.2軟件(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

2.3 質(zhì)譜分析 加巴噴丁和內(nèi)標(biāo)磺胺二甲異嘧啶在電噴霧離子化方式下,主要生成[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰,分別為m/z 172和m/z 279。選擇性對上述離子峰進(jìn)行二級質(zhì)譜分析,加巴噴丁的主要碎片離子為m/z 154.1(脫去一分子H2O),內(nèi)標(biāo)的主要碎片離子為m/z 124(脫二甲氨基嘧啶),并將其作為定量分析時監(jiān)測的產(chǎn)物離子。典型的碎片離子圖見圖1。

圖 1 加巴噴丁(A)及內(nèi)標(biāo)磺胺二甲異嘧啶(B)的質(zhì)譜圖Figure 1 The mass spectrum photograms of gabapentin(A)and internal standard sulphadimethyl iso-pyrimidine(B)

2.4 血清樣品處理 精密稱取加巴噴丁和磺胺二甲異嘧啶適量,分別加甲醇配制成濃度為1.0 mg/ml的加巴噴丁標(biāo)準(zhǔn)儲備液和0.9 mg/ml的磺胺二甲異嘧啶標(biāo)準(zhǔn)儲備液。取 100 μ l血清,加入濃度為900 ng/ml內(nèi)標(biāo)工作溶液 10 μ l,乙腈 200 μ l,渦旋30 s,室溫 1.5×104r/min(離心半徑 11 cm)離心2 min,吸取上清液作為進(jìn)樣液。

2.5 線性關(guān)系考察 在血清中依次加入加巴噴丁標(biāo)準(zhǔn)儲備液,配制成相當(dāng)于加巴噴丁血清濃度為50 、100 、250、1 250、2 500、5000 ng/ml的血清樣品,按2.4項下操作,取 5 μ l進(jìn)樣分析。以待測物濃度為x,待測物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為Y,其加權(quán)(1/x)線性回歸后,加巴噴丁的回歸方程為:Y=0.008463x-0.019 22(r=0.999 6)。結(jié)果表明,加巴噴丁在50～5000 ng/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。加巴噴丁的最低定量限為50 ng/ml(S/N＞10∶1)。

2.6 方法專一性 取6個不同來源人的空白血清,每個來源的空白血清分別配制成含加巴噴丁低、中濃度(150、2000 ng/ml)質(zhì)控血清樣品各3份和3份空白血清,共計54份樣品,按照2.4項下處理步驟操作并進(jìn)樣分析。結(jié)果表明,內(nèi)源性物質(zhì)對加巴噴丁和內(nèi)標(biāo)的測定無干擾(見圖2)。6個不同來源人血清低、中濃度質(zhì)控測定結(jié)果的準(zhǔn)確度均在91.8%～105.1%,RSD均＜6%,基質(zhì)對測定結(jié)果影響很小,方法專一性強(qiáng)。

圖2 人血清中加巴噴丁及內(nèi)標(biāo)磺胺二甲異嘧啶的HPLC譜圖Figure 2 HPLC photograms of gabapentin and internal standard sulphadimethyl iso-pyrimidine in human serum

2.7 提取回收率 測定低、中、高濃度(150、2000、4000 ng/ml)的質(zhì)控血清各6份,得到峰面積B1,另取空白血清按2.4項方法進(jìn)行處理,加入適量加巴噴丁和內(nèi)標(biāo)的工作溶液,配制成與質(zhì)控血清理論進(jìn)樣濃度相同的溶液進(jìn)樣分析,得到峰面積B2;以B/B2的值計算提取回收率。結(jié)果表明,加巴噴丁在低、中、高濃度和內(nèi)標(biāo)濃度為900 ng/ml時的提取回收率分別為 108.5%、97.7%、107.7%和109.9%,RSD%分別為 9.8%、3.3%、5.5%和11.5%。

2.8 精密度實驗 取低、中、高濃度的質(zhì)控血清各6份,連續(xù)制備3批,按照2.4項下方法操作并進(jìn)樣分析,以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算質(zhì)控血清樣品的濃度,計算相對回收率為92.4%～110.4%,批內(nèi)、批間RSD均＜10%(n=6)。

2.9 穩(wěn)定性考察 取低、中、高3種濃度的質(zhì)控血清樣品,按2.4項下方法處理后,分別在室溫下放置0、6、12和18 h時進(jìn)樣測定。樣品凍融穩(wěn)定性是將血清樣品置-20℃避光保存,然后在室溫下自然解凍,按2.4項下方法處理后進(jìn)樣,如此反復(fù)2次。結(jié)果表明,預(yù)處理好的血清質(zhì)控樣品在室溫放置18 h內(nèi)穩(wěn)定,血清質(zhì)控樣品經(jīng)過2次凍融后仍穩(wěn)定,RSD均＜10%(n=3)。

3 討 論

國外有文獻(xiàn)報道用LC-MS/MS法[4]測定人血清中加巴噴丁含量,采用液液萃取法進(jìn)行樣品預(yù)處理,需要用氮氣吹干,過程繁瑣、耗時。本研究在該方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化,采用乙腈直接沉淀蛋白質(zhì)進(jìn)行樣本處理,操作過程更加簡便。在摸索條件時發(fā)現(xiàn),在流動相中加入0.02%甲酸,能夠提高離子化效率,改善峰形,同時靈敏度也有所提高。

本研究建立的LC-MS/MS測定人血清中加巴噴丁含量的方法是本實驗室抗精神類藥物和抗抑郁類藥物治療藥物監(jiān)測平臺的一部分,該平臺包括有32種藥物的監(jiān)測,根據(jù)臨床常用以及市場上能購買到的標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌愤x擇藥物。在平臺開發(fā)后,作者也開展了一些治療藥物監(jiān)測以及生物利用度研究,但由于本院使用加巴噴丁的病人很少,所以沒有臨床樣本監(jiān)測。今后計劃與上海地區(qū)各家精神衛(wèi)生中心聯(lián)系,希望能獲得一些臨床樣本開展治療藥物監(jiān)測,檢驗本方法的實用性。

[1] 龔志毅,葉鐵虎,郝絨絨,等.加巴噴丁治療帶狀皰疹后神經(jīng)痛的有效性和安全性研究[J].中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志,2008,14(2):72-77.Gong ZhiYi,Ye TieHu,Hao Rong Rong,et al.The efficacy and safety of gabapentin in postherpetic neuralgia[J].Chin J Pain Med,2008,14(2):72-77.Chinese with abstract in Enlish.

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