龔德華 季大璽 朱冬冬 徐 斌 崔 俊 劉志紅

抗中性粒細胞胞質抗體(ANCA)相關血管炎(AAV)是一組血清ANCA陽性，臨床表現為多系統(tǒng)小血管炎性損害的疾病。AAV常累及肺部及腎臟，腎臟損害多表現為急進性腎炎。在疾病的急性發(fā)作期，特別是危及患者生命的臨床癥狀出現時，治療的關鍵是快速誘導疾病的緩解，減輕及逆轉臟器損害，方法包括大劑量甲潑尼龍聯合免疫抑制劑治療。盡管目前診斷技術及治療方法不斷改進，仍有相當部分患者由于嚴重并發(fā)癥導致死亡，或出現終末期腎病(ESRD)，嚴重影響患者長期預后。國外資料顯示5年內20%患者出現ESRD［1］，而國內資料則顯示1年和3年腎存活率分別為66.8%和58.5%［2，3］。就診時即有明顯腎功能損害者預后更差，且對藥物治療反應不佳。目前發(fā)現的ANCA主要有兩種類型，即針對中性粒細胞胞質嗜中性顆粒及單核細胞溶酶體髓過氧化物酶(MPO－ANCA)及針對蛋白酶 3(PR3－ANCA)的抗體。現認為ANCA在疾病的發(fā)病中起重要作用，且抗體滴度與疾病的活動度密切相關［4］。因此臨床實踐中也采用體外循環(huán)血液凈化方法從循環(huán)中迅速清除致病性抗體，以期誘導疾病的緩解。血漿置換(PE)是一種常用的清除自身抗體的方法。其優(yōu)點是簡便易行，缺點是其清除非選擇性，丟失大量有用血漿蛋白，需補充大量人體白蛋白或血漿［5］。在此基礎上的改進方法為雙重血漿置換(DFPP)，即先采用血漿分離器(一級濾器，膜孔0.2～0.5 μm)將血漿分離出來，血漿再經過血漿成分分離器(二級濾器，膜孔0.01～0.02 μm)濾過，分子量較小的血漿成分(主要為白蛋白及小分子蛋白)被二級濾器濾出后回輸體內，而分子量較大的血漿成分(主要為免疫球蛋白，包含自身抗體)被截留而丟棄。DFPP由于相對選擇性清除血漿大分子蛋白，減少了白蛋白的丟失及補充量，可增加單次治療處理血漿量，有助提高致病性抗體的清除率［6］。雖然DFPP較PE清除蛋白的選擇性增加，但同樣存在大量有用蛋白丟失的問題，如非致病性免疫球蛋白及大分子凝血因子的丟失［7］。目前少有研究報道如何進一步提高DFPP清除蛋白的選擇性，減少有用蛋白的丟失。本文提出一種新的DFPP方法，用于治療AAV患者，即選擇性血漿分離器行DFPP，觀察對免疫球蛋白及ANCA的清除情況，并與原有DFPP方法，即采用普通血漿分離器與血漿成分分離器聯合進行了對比，現報告如下。

對象和方法

研究對象 2010年4月至2011年4月南京軍區(qū)南京總醫(yī)院全軍腎臟病研究所共對15例確診為MPO－ANCA相關血管炎伴腎功能不全患者行DFPP治療44次。患者男性9例，女性6例，平均年齡(53.9±15.6)歲(43～72歲)，臨床均表現為急進性腎炎，治療前平均血清肌酐(SCr)(433.16±88.4)μmol/L，腎外并發(fā)癥3例(突發(fā)性耳聾1例，咯血2例)。藥物治療方案如下:甲潑尼龍0.5g，靜脈滴注，連續(xù)3d，后予口服潑尼松30～45 mg/d維持，同時口服霉酚酸酯0.5 g/d，1例患者雷公藤多苷60 mg/d?；颊咴诩诐娔猃堉委熃Y束后開始DFPP治療。所有患者或其家屬均簽署知情同意書。

DFPP方法 均采用右側頸內靜脈留置雙腔導管作血管通路，DFPP采用血液凈化裝置 IQ21(Asahi Kasei Kuraray Medical CO，Ltd，日本)進行，體外循環(huán)聯接示意圖見圖1，采用低分子肝素聯合枸櫞酸抗凝，使活化凝血時間延長一倍以上。血流量設置為120～150 ml/min，一級濾器血漿分離流量為30～40 ml/min，二級濾器再循環(huán)流量為 60 ml/min。治療步驟如下:(1)治療開始時，一級濾器濾出血漿進入二級濾器再次濾過，濾出的血漿再經一微濾器后回輸體內(微濾器起超濾脫水的作用)，被截留的血漿成分滯留在二級濾器中不斷再循環(huán)，此時二級濾器后通往棄漿袋的三通呈關閉狀態(tài);(2)當二級濾器前壓力逐步升高，超過150～160 mmHg時，將一級濾器后三通轉向生理鹽水通路，停止分離血漿，采用生理鹽水800 ml沖二級濾器，使二級濾器中滯留血漿成分進一步濾過回輸體內;(3)生理鹽水沖濾器完畢后，將二級濾器后的三通轉向棄漿袋，使二級濾器中仍殘留的血漿成分進入棄漿袋丟棄。這一過程即為一個循環(huán)，結束后即將一級濾器后的三通轉向血漿分離通路，繼續(xù)分離血漿及處理血漿，開始下一治療循環(huán)。處理血漿達2倍血漿容量時即結束治療。整個過程中共補充人體白蛋白30～40g。意大利，面積0.68m2，最大孔徑0.5 μm)作一級濾器，采用 EC50W(Asahi Kasei Medical CO，Ltd，日本，面積2.0m2，孔徑0.03 μm)作二級濾器。有1例患者采用此種方法行DFPP 3次，因清除免疫球蛋白G(IgG)不理想，后續(xù)患者未再采用此方法。

圖1 雙重血漿濾過體外循環(huán)聯接示意圖

MPS07/EC20W組 采用MPS07作一級濾器，采用 EC20W(Asahi Kasei Medical CO，Ltd，日本，面積2.0m2，孔徑0.01 μm)作二級濾器，有9例患者采用此種方法行DFPP 27次。

EC50W/EC20W組 采用EC50W作一級濾器，采用EC20W作二級濾器。最后5例患者采用此種方法行DFPP 14次。

標本采集 患者在每次治療前后采血;每次治療第一循環(huán)第一步驟結束時，同時從第1、第2、第3及第4采血點取標本;第二步驟結束時，同時從第3及第4采血點取標本;每次治療結束時稱取廢棄血漿重量及留取廢液標本。留取的標本檢測血漿總蛋白、球蛋白、白蛋白及 IgA、IgG、IgM 水平及 MPOANCA滴度。MPO－ANCA采用ELISA方法檢測，所用MPO購自SCIMEDX公司(美國)。

計算公式

濾器選擇 本研究為非隨機、前瞻性觀察性研究，擬對比三種方法對免疫球蛋白及自身抗體的清除情況。根據患者所使用濾器，分為三組:

MPS07/EC50W組 采用MPS07(Bellco s.p.a，

單次治療下降百分率(R)=(1－治療后濃度/治療前濃度)×100%

一級濾器篩選系數(SC)=采血點2濃度/采血點1濃度

二級濾器篩選系數(SC)=采用點3濃度/采血點4濃度

清除指數=(廢液濃度×廢液量)/(治療前血液濃度×血漿容量)

白蛋白清除指數=(廢液白蛋白濃度×廢液量)/(治療前血清白蛋白濃度×血漿容量+補充白蛋白量)

統(tǒng)計學方法 分析采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包，結果采用均數±標準差表示。治療前后濃度比較采用成對樣本均數比較的student－t檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學差異。

結 果

15 例患者共接受44次DFPP治療，治療過程順利，無一例患者出現治療相關的嚴重不良反應。治療結束后，2例咯血患者癥狀緩解，15例患者腎功能穩(wěn)定，無需腎臟替代治療，1例治療前已開始腎臟替代治療患者，腎功能未恢復，改為維持性透析治療。所有患者血ANCA滴度顯著下降。

三種濾器的篩選系數 MPS07為一級血漿分離器，能濾過絕大部分血漿白蛋白、IgA、IgG及IgM;EC50W為二級血漿成分分離器，但膜孔徑相對較大，能濾過大部分白蛋白，部分 IgA、IgG及少量IgM;EC20W為膜孔徑較小的二級血漿成分分離器，只能濾過部分白蛋白及IgG，少量IgA，及極少量IgM(圖2)。

圖2 血漿蛋白篩選系數

單次治療血漿蛋白下降百分率 三種方法對白蛋白的清除相當，每次治療補充30～40g人體白蛋白情況下，對血漿白蛋白影響不明顯。MPS07/EC50W組合對IgM清除最突出，其次為IgA，而對IgG清除則相對較少;MPS07/EC20W組合對三種免疫球蛋白清除都很明顯;EC50W/EC20W組合對IgA及IgG清除較明顯，而對IgM則基本不清除(圖3)。

圖3 單次治療血漿蛋白下降百分率

MPS07/EC20W與EC50W/EC20W組合對ANCA的清除 MPS07/EC20W及EC50W/EC20W兩種組合單次治療IgG下降率分別為(51.0±10.0)%及(43.5±13.8)%，而MPO－ANCA水平下降率分別為(31.1±14.0)%及(34.6±14.3)%(表1)。

EC50W/EC20W組合DFPP每一循環(huán)中生理鹽水沖二級濾器前后對濾器中蛋白濃度的影響 當每一循環(huán)中二級濾器前壓力達到150～160 mmHg時，測定二級濾器血漿白蛋白及IgG濃度顯著升高，在采用生理鹽水沖濾器后兩者都顯著下降，而白蛋白更明顯(表2)。濾器中IgG/白蛋白濃度比在沖濾器后升高24.2%。

表1 采用不同血漿分離器行雙重血漿置換對血漿蛋白的清除

表2 生理鹽水沖洗前后二級濾器中蛋白濃度變化(n=5)

討 論

采用體外循環(huán)血液凈化方法清除體內致病性物質已在臨床廣泛用于治療自身免疫性疾病，如重癥肌無力，ANCA相關血管炎，抗GBM抗體介導肺腎綜合征等。血液凈化方法包括PE和免疫吸附等［8－10］。其中PE由于方法簡單使用相對普遍。與PE相比，DFPP相對選擇性清除血漿中分子量較大的致病物質，而分子量較小的白蛋白則被回收體內，減少有用物質的丟失及所需外源性蛋白的補充量，在臨床使用也逐漸增多。

應用DFPP時，首先需選擇濾器，通常是選擇血漿分離器作一級濾器，將血液中所有血漿成分濾出，再選擇血漿成分分離器作二級濾器，對一級濾過的血漿再次濾過，回收小分子蛋白(主要是白蛋白)，而不能濾過物質(主要是免疫球蛋白)則被丟棄。血漿成分分離器根據其膜孔徑不同分為不同型號，本文測定了EC50W及EC20W兩種濾器對不同蛋白的清除特性。結合這一特性，臨床可根據欲清除致病物質的分子量大小選擇不同二級濾器。選擇MPS07/EC50W組合，最突出的是對IgM的清除，單次治療下降率可達90%，而對IgG則影響較小，因此可用于一些分子量特別大的致病物質的清除，如華氏巨球蛋白血癥的 IgM［11］，高脂血癥中的脂蛋白［12，13］。日本較多報道用于丙型肝炎病毒(HCV)感染患者的治療，主要通過這種方法大量清除血液中的HCVRNA病毒顆粒，從而降低體內病毒負荷，提高患者對后續(xù)藥物治療的反應性［14－16］。Hanafusa 等［7］采用這種方法治療，IgG下降率18.6% ～21.9%，而LDL下降率則達63.7% ～65.6%，與本文結果相同。而自身免疫性疾病的致病性抗體，如ANCA，多為IgG型，少有IgM及IgA型自身抗體，如部分抗心磷脂抗體及類風濕因子。因此針對IgG型自身抗體，采用MPS07/EC50W組合并不合適。第二種選擇為MPS07/EC20W組合方式。從本文結果可知，這種方式對血漿中除白蛋白以外大分子蛋白清除都較顯著，特別是IgM及IgA。而對于多數自身免疫性疾病患者而言，欲清除物質主要是IgG，采用這種方式治療必然帶來大量大分子蛋白的丟失，如IgM，IgA和一些大分子凝血物質。Tanabe［17］采用類似方式治療患者在清除IgG達60%的同時，也清除70%的IgM。Hanafusa等［7］采用同樣組合方式治療可使患者血液中凝血因子Ⅷ活性嚴重降低。

為進一步提高清除物質的選擇性，本文提出了EC50W/EC20W組合方式，即采用一個膜孔相對較大的血漿成分分離器作一級濾器，一個膜孔徑相對較小的血漿成分分離器作二級濾器。EC50W作為一級濾器，只分離血液中欲清除的IgG，而不需清除的物質如IgM則不被分離，亦不被二級濾器所清除。因此采用這種方式治療后，對IgM水平無明顯影響。且每次治療只需補充人體白蛋白30～40g(相當于血漿800～1 000 ml)，可使血漿IgG下降43.5%，MPO－ANCA滴度下降34.6%，對IgG的清除指數較白蛋白清除指數高1.6倍。雖然本文未測定對凝血因子的影響，但可推測與IgM分子量相當的物質可被大量保留，從而進一步減少有用物質的丟失，減少DFPP相關并發(fā)癥。通過相關文獻檢索，本文所提出的這種組合方式還未見國內外其他作者報道。當然，采用這種方式單次治療IgG下降率略低于傳統(tǒng)方式［(43.5±13.8)%vs(51.0±10.0)%，P ＞0.05］，但奇怪的是ANCA水平的下降率則無明顯差別［(34.6±14.3)%vs(31.1±14.0)%，P ＞0.05］。

目前臨床所使用的DFPP方法一般采用兩種棄漿方式，即連續(xù)式和間斷式棄漿方式。前者即一級濾器分離出血漿以30～40 ml/min的速率進入二級濾器中被再次濾過，不能濾過的蛋白在二級濾器中被濃縮，濃縮液被以3～4 ml/min的速率連續(xù)丟棄;而間斷式棄漿方式則不連續(xù)丟棄濃縮液，使之不斷被濃集，二級濾器壓力逐步升高，當壓力達到一定程度，即用生理鹽水將二級濾器中滯留的蛋白沖入棄漿袋中丟棄。我們發(fā)現，在廢棄血漿中白蛋白濃度仍較高，如能將之再過濾，必可進一步減少白蛋白丟失。因此本文在采用間斷棄漿方式基礎上作了兩點改進:一是增加了再循環(huán)泵，使二級濾器中的濃縮液不斷再循環(huán)，不至于堵塞二級濾器導致效率降低;二是在二級濾器壓力升高達到閾值后，并不直接棄漿，而是采用生理鹽水將其再濾過后才棄漿。通過這種改進發(fā)現，可使二級濾器中白蛋白濃度降低42%，IgG降低28.2%，使濾器中IgG/白蛋白濃度比升高24.2%，即進一步減少了白蛋白的丟失。Jiang等［18］報道DFPP治療頑固性蕁麻疹，在補充20g人體白蛋白情況下，患者血漿白蛋白從35.4 g/L顯著降至21.8 g/L。而Ramumni等報道的DFPP治療單次IgG下降率僅為28.8%［19］。與這些報道結果相比，本文提出的改進DFPP方法在只需補充人體白蛋白30～40g情況下對血漿白蛋白無影響，且獲得較好的IgG下降率及有效降低MPO－ANCA滴度。

本文還觀察到IgG與ANCA水平下降不平行，即部分患者治療前后IgG下降幅度很大，而ANCA水平則無明顯下降。本文表1結果也顯示，MPS07/EC20W組IgG下降率高于EC50W/EC20W組［(51.0±10.0)%vs(43.5±13.8)%，P ＞0.05］，但其 MPO－ANCA下降率反不如后者［(31.1±14.0)%vs(34.6±14.3)%，P ＞0.05］。造成這些現象的具體原因尚不清楚。在這部分患者棄去廢血漿中亦檢出大量ANCA被清除。我們推測可能與ANCA的體內分布有關:有的患者ANCA主要存在于循環(huán)中，因此血IgG與ANCA平行下降;而有的患者ANCA則可能大量沉積于組織，當血液中水平略有下降時，組織中ANCA即重新進入循環(huán)，導致循環(huán)中ANCA水平變化不明顯。

小結:DFPP是一種能有效清除血液中致病性大分子物質的血液凈化方法，且需補充蛋白量少，值得臨床推廣使用。臨床應根據欲清除的致病性物質特性來選擇不同一級濾器及二級濾器。針對血管炎致病性抗體MPO－ANCA，筆者提出以血漿成分分離器EC50W作一級濾器，EC20W作二級濾器的新組合方式，改進了原有的DFPP方法，同時證實進一步增加了DFPP清除物質的選擇性，避免有用大分子物質丟失，但可能輕度降低IgG下降率。臨床觀察可有效降低患者血清MPO－ANCA滴度，但對患者臨床癥狀及預后的影響還需擴大病例及進一步的研究觀察。

1 Hamour S，Salama AD，Pusey CD.Management of ANCA－associated vasculitis:Current trends and future prospects.Ther Clin Risk Manag，2010，6:253 －264.

2 胡偉新，劉春蓓，唐 政，等.微型多血管炎腎損害的預后.腎臟病與透析腎移植雜志，2004，13(5):419－425.

3 Hu WX，Liu ZH，Liu CB，et al.Prognosis of microscopic polyangiitis with renal involvement:report of 60 Chinese patients.Chin Med J(Engl)，2005，118(24):2089 －2092.

4 Belmont HM.Treatment of ANCA－associated systemic vasculitis.Bull NYU Hosp Jt Dis，2006，64(1 －2):60 －66.

5 Jayne DR，Gaskin G，Rasmussen N，et al.Randomized trial of plasma exchange or high－dosage methylprednisolone as adjunctive therapy for severe renal vasculitis.J Am Soc Nephrol，2007，18(7):2180 －2188.

6 Nakaji S，Yamamoto T.Membranes for therapeutic apheresis.Ther Apher，2002，6(4):267 －270.

7 Hanafusa N，Satonaka H，Doi K，et al.Virus Removal and Eradication by Modified Double Filtration Plasmapheresis Decreases Factor XIII Levels.Ther Apher Dial，2010，14(3):287 －291.

8 Hu W，Liu Z，Ji D，et al.Staphylococcal protein A immunoadsorption for Goodpasture＇s syndrome in four Chinese patients.J Nephrol，2006，19(3):312－317.

9 Langford CA.Small－vessel vasculitis:therapeutic management.Curr Rheumatol Rep，2007，9(4):328 －335.

10 Molloy ES，Langford CA.Advances in the treatment of small vessel vasculitis.Rheum Dis Clin North Am，2006，32(1):157 －172.

11 Neparidze N，Dhodapkar MV.Waldenstrom＇s Macroglobulinemia:Recent Advances in Biology and Therapy.Clin Adv Hematol Oncol，2009，7(10):677 －681，687 －690.

12 Koziolek MJ，Hennig U，Zapf A，et al.Retrospective analysis of longterm lipid apheresis at a single center.Ther Apher Dial，2010，14(2):143－152.

13 Ewald N，Kloer HU.Severe Hypertriglyceridemia:An indication for apheresis?Atheroscler Suppl，2009，10(5):49 －52.

14 FujiwaraK，Kaneko S，Kakumu S，etal.Double filtration plasmapheresisand interferon combination therapy forchronic hepatitis C patients with genotype 1 and high viral load.Hepatol Res，2007，37(9):701 －710.

15 Taniguchi M，Furukawa H，Shimamura T，et al.Impact of doublefiltration plasmapheresis in combination with interferon and ribavirin in living donor liver transplantrecipients with hepatitis C.Transplantation，2006，81(12):1747 －1749.

16 Namba T，Shiba R，Yamamoto T，et al.Successful treatment of HCV－related cryoglobulinemic glomerulonephritiswith double－filtration plasmapheresis and interferon combination therapy.Clin Exp Nephrol，2010，14(4):372 －376.

17 Tanabe K.Double－Filtration Plasmapheresis.Transplantation，2007，84(12 Suppl):S30－S32.

18 Jiang X，Lu M，Ying Y，et al.A Case Report of Double－Filtration Plasmapheresis for the Resolution of Refractory Chronic Urticaria.Ther Apher Dial，2008，12(6):505 － 508.

19 Ramunni A，De Robertis F，Brescia P，et al.A Case Report of Double Filtration Plasmapheresis in an Acute Episode of Multiple Sclerosis.Ther Apher Dial，2008，12(3):250 － 254.