李強(qiáng)棟，孟 林，毛培春，張德罡，韓潤(rùn)英

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院 北京草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心，北京 100097；3.內(nèi)蒙古通遼市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

馬藺（Iris lactea）系鳶尾科鳶尾屬多年生草本植物，廣泛分布我國(guó)華北、西北、東北、華東和青藏高原等地。生長(zhǎng)在較低濕的鹽堿灘地以及高山河谷地區(qū)，可稱為優(yōu)勢(shì)單純的群落，尤以過(guò)度放牧的鹽堿化草地上較多，而在重鹽漬化和地下水位較深的干燥環(huán)境較少。馬藺具有耐鹽堿、耐粗放管理、抗旱抗寒性強(qiáng)等特點(diǎn)，花色淡雅、葉色澤青綠柔軟厚實(shí)、病蟲(chóng)害少、修剪頻率少，是優(yōu)良的生態(tài)觀賞地被植物，在綠化、水土保持、植被恢復(fù)等方面具有開(kāi)發(fā)潛力［1，2］。近年來(lái)，科學(xué)工作者對(duì)馬藺的研究集中在形態(tài)結(jié)構(gòu)特征與地理分布關(guān)系、破除種子休眠、提高發(fā)芽率、抗旱抗寒性、耐鹽堿能力及其他抗逆性鑒定、引種及馴化和栽培、組織培養(yǎng)和繁殖推廣等方面［3］，而關(guān)于馬藺種質(zhì)材料遺傳多樣性方面的工作報(bào)道較少［4，5］。

酶是基因表達(dá)的產(chǎn)物，酶蛋白多肽鏈結(jié)構(gòu)中的氨基酸順序是由DNA上結(jié)構(gòu)基因所攜帶的遺傳信息決定的，而同工酶分析是通過(guò)電泳技術(shù)把酶蛋白分子分離，然后通過(guò)組織化學(xué)特異性染色將其位置和活性直接在染色區(qū)帶以酶譜形式標(biāo)記出來(lái)。因此，通過(guò)對(duì)酶譜分析就能識(shí)別控制這些譜帶所表達(dá)的基因，從而在生化水平上研究植物體遺傳變異［6，7］。1980年Brewbaker等對(duì)玉米（Zea mays）同工酶電泳發(fā)現(xiàn)，玉米中過(guò)氧化物酶同工酶存在不同組織及不同生長(zhǎng)階段的多型現(xiàn)象［8］，之后關(guān)于植物不同組織器官、不同生長(zhǎng)階段同工酶差異性已有較多報(bào)道，而且不同種類同工酶具有生長(zhǎng)階段和組織特異性［9，10］。

以采自我國(guó)北方5省區(qū)11份野生馬藺為實(shí)驗(yàn)種子，繁殖后分別于營(yíng)養(yǎng)階段和生殖生長(zhǎng)階段隨機(jī)選取其健康功能葉用于同工酶分析，通過(guò)分析營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段及生殖生長(zhǎng)階段的POD和EST（POD，E.C.1.11.1.7；EST，E.C.3.2.1.1）酶譜特征的變化，探討2種同工酶的多種分子形式在不同居群間的表型特征與遺傳結(jié)構(gòu)之間的連續(xù)性、穩(wěn)定性及變異性，酶蛋白的多種分子形式所具有生長(zhǎng)階段特異性及不同組織器官特異性。以期在生化水平上，為利用同工酶技術(shù)分析馬藺種質(zhì)材料遺傳多樣性提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源

以采集的我國(guó)北方5省區(qū)不同生境分布的11份野生馬藺種子為實(shí)驗(yàn)材料（表1）。

表1 實(shí)驗(yàn)馬藺種質(zhì)材料及其來(lái)源Table 1 Source of tested germplasms

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 日光溫室 將收集到的不同生境馬藺種子，于2009年在北京市農(nóng)林科學(xué)院草業(yè)中心日光溫室種子繁殖，幼苗培育之后移栽大田管理。育苗時(shí)在內(nèi)徑21 cm，高18cm的花盆裝入3kg培養(yǎng)基質(zhì)（過(guò)篩土∶草炭＝2∶1），每份材料3次重復(fù)，每重復(fù)50粒種子［3］。大田生長(zhǎng)及時(shí)除雜、澆水。

1.2.2 酶液提取 分別剪取不同生長(zhǎng)階段馬藺幼嫩葉片1g，洗凈并剪碎放入預(yù)冷的研缽。先加入2mL預(yù)冷的緩沖液（POD 0.065mol/L Tris－檸檬酸 pH 8.2；EST 1mol/L Tris－HCl pH 8.3），在冰浴中研磨，沖洗于5mL離心管中，在10 000r/min 4℃冷凍離心機(jī)中離心5min，取上清液加入等體積10%甘油，分裝于0.3mL離心管中，保存于－20℃冰箱以備點(diǎn)樣［7］。

1.2.3 電泳及染色 參照文獻(xiàn)［11］電泳體系及凝膠染色方法，并做適當(dāng)調(diào)整。POD用改良聯(lián)苯胺法染色，EST采用萘酯－偶氮色素法染色。染色后的膠版用7%冰醋酸漂洗固定脫色。重復(fù)多次，選取清晰、整齊的凝膠拍照并作進(jìn)一步分析。

1.2.4 凝膠分析 凝膠譜帶的不同染色深度表示酶活性強(qiáng)弱，將酶活性劃分為4個(gè)等級(jí)，從4至1依次為強(qiáng)、較強(qiáng)、弱、最弱。根據(jù)各個(gè)譜帶的遷移距離計(jì)算其相對(duì)電泳遷移率（Rf＝凝膠中譜帶遷移距離/前沿指示劑遷移距離），同時(shí)繪制凝膠酶譜模式圖［12］。

2 結(jié)果與分析

2.1 同工酶酶譜特征分析

通過(guò)酶電泳實(shí)驗(yàn)，研究了11份馬藺種質(zhì)材料在營(yíng)養(yǎng)和生殖生長(zhǎng)階段的POD和EST同工酶（圖1～4）。結(jié)果表明，供試材料POD和EST共顯示出了22個(gè)不同酶帶，即POD－A～POD－M 和EST－A～EST－I。依照經(jīng)驗(yàn)［13］，將酶帶劃分為快、慢兩區(qū)，其中 POD－A～POD－H 和 EST－A～EST－H 為慢區(qū)（SS），POD－H～POD－M 和 EST－I為快區(qū)（FF），其 Rf介于0.041～0.875（表2、3）。其中，POD－A、D、F、J和 EST－A、D、E、I為馬藺的基本譜帶，而POD－E、G和EST－B、G等4條譜帶僅出現(xiàn)在2、3和10號(hào)馬藺種質(zhì)材料，其Rf分別為0.196、0.227、0.583，0.713，為材料所具有的特征譜帶?；咀V帶是不同居群間種質(zhì)材料具有相同起源基因的證明，而4條特征酶帶表明了植物在不同的生態(tài)地理環(huán)境中發(fā)生了不同的趨異分化，這些譜帶可作為植物在不同生長(zhǎng)階段，組織與器官系統(tǒng)發(fā)育的特異性指標(biāo)，以及鑒定品種和物種分類的指標(biāo)［14－16］。

2.2 不同生長(zhǎng)階段EST同工酶分析

隨著植株從營(yíng)養(yǎng)到生殖生長(zhǎng)階段，EST總酶帶數(shù)由65條減少到61條，酶帶數(shù)變化不大（圖1b，2b）。其中，1號(hào)材料 EST－F，2號(hào) EST－H，4號(hào) EST－F，5號(hào)EST－F、－H酶帶在生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)生缺失現(xiàn)象；5號(hào)材料出現(xiàn)EST－C酶帶。相比較營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，生殖生長(zhǎng)階段的EST基本譜帶沒(méi)有發(fā)生缺失或增加現(xiàn)象，僅在酶活性方面有變化。如1，2和3號(hào)馬藺種質(zhì)材料的EST－A酶帶由2級(jí)降為1級(jí)，4～9號(hào)材料的EST－A酶帶由3級(jí)降為2級(jí)，1～4號(hào)的EST－C酶帶較營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段降了1級(jí)；2號(hào)的EST－C與6、7號(hào)的EST－D酶帶由2級(jí)變?yōu)?級(jí)。其中，特征譜帶3號(hào)EST－B和10號(hào)EST－G酶帶的酶活性降低。表明馬藺在不同生長(zhǎng)階段EST存在變化，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段EST酶譜的酶活性較生殖生長(zhǎng)階段更強(qiáng)，酶譜表現(xiàn)也更清晰（圖1a、2a）。

圖1 馬藺種質(zhì)材料營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段EST酶譜及模式圖Fig.1 The EST photograph and ideogram of Chinese Irisin vegetative growth stage

圖2 馬藺種質(zhì)材料生殖生長(zhǎng)階段EST酶譜及模式圖Fig.2 The EST photograph（a）and ideogram（b）of Chinese Irisin reproductive growth stage

表2 馬藺種質(zhì)材料不同生長(zhǎng)階段EST酶帶數(shù)及遷移率Table 2 Total EST bands and Rf value of Chinese Irisin vegetative and reproductive growth stages

2.3 不同生長(zhǎng)階段POD同工酶分析

隨著植株從營(yíng)養(yǎng)階段到生殖生長(zhǎng)階段，POD總酶帶數(shù)仍為79條，酶帶數(shù)沒(méi)有發(fā)生變化，但在不同遷移率帶的缺失及酶活性方面發(fā)生變化（圖3b、4b）。其中，材 料2號(hào) POD－B、－E、－G、－J、－K 酶 帶，5 號(hào) POD－J酶帶，10號(hào)POD－A、－J酶帶在生長(zhǎng)推進(jìn)過(guò)程中發(fā)生缺失現(xiàn)象，而部分材料較營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段有新酶帶出現(xiàn)，如2號(hào)的POD－B、－F酶帶，3號(hào)的POD－C酶帶，6號(hào)POD－B酶帶，8號(hào) POD－A 酶帶，9號(hào)的 POD－J、－K 酶帶，10號(hào)POD－D、－L酶帶。酶活性變化也相當(dāng)豐富，如1號(hào)材料 POD－F、－J、－K 酶 帶，2 號(hào) POD－A、－L 酶 帶，4 號(hào)POD－F酶帶，5號(hào) POD－B酶帶，8號(hào) POD－B、－C、－D 等酶帶的酶活性隨著生長(zhǎng)階段推進(jìn)而降低；材料3號(hào)的POD－J、－K，4 號(hào) POD－J，6 號(hào) POD－H、－K，9 號(hào) PODH、－I等酶帶的酶活性增強(qiáng)。說(shuō)明POD酶活性同樣隨著植物生長(zhǎng)階段的不同發(fā)生變化，在生殖生長(zhǎng)階段POD酶譜的酶活性較營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段更強(qiáng)，酶譜表現(xiàn)也較清晰（圖3a、4a）。

圖3 馬藺種質(zhì)材料營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段POD酶譜及模式圖Fig.3 The POD photograph（a）and ideogram （b）of Chinese Irisin vegetative growth stage

圖4 馬藺種質(zhì)材料生殖生長(zhǎng)階段POD酶譜及模式圖Fig.4 The POD photograph（a）and ideogram（b）of Chinese Irisin reproductive growth stage

3 討論與結(jié)論

3.1 馬藺同工酶技術(shù)應(yīng)用

同工酶技術(shù)作為檢測(cè)物種遺傳多樣性的一種生化標(biāo)記方法，隨著酶譜技術(shù)研究的迅速發(fā)展及讀譜技術(shù)的成熟，酶電泳信息數(shù)據(jù)的處理與分析對(duì)系統(tǒng)分子進(jìn)化、發(fā)生和遺傳的研究越來(lái)越重要。丁毅等［17］采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析了產(chǎn)于我國(guó)不同地區(qū)的近緣野生大麥及栽培大麥，指出近緣野生大麥同栽培大麥之間具有相同的酶譜類型，在育種過(guò)程中選取不同類型酶譜或者酶譜相同而地理距離較遠(yuǎn)的材料進(jìn)行雜交配組。韓天文等［18］用同工酶技術(shù)對(duì)5個(gè)蘇丹草（Sorghum sudanense）品種酯酶同工酶進(jìn)行分析，指出蘇丹草幼苗葉片相比較根部酯酶譜帶較少，同時(shí)利用Rf為0.84位點(diǎn)能夠快速有效地區(qū)分5個(gè)蘇丹草品種。張雪婷等［19］通過(guò)對(duì)隴東野生紫花苜蓿過(guò)氧化物酶同工酶譜的研究，發(fā)現(xiàn)其與多數(shù)苜蓿種質(zhì)材料存在較大的遺傳差異，單獨(dú)聚為一類。

由此看出，同工酶技術(shù)應(yīng)用于物種遺傳變異、植物細(xì)胞分化和個(gè)體發(fā)育、親緣關(guān)系鑒定和植物育種方面研究具有實(shí)際意義，可以作為重要的遺傳標(biāo)志。此次實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)馬藺2個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段同工酶譜變化分析，發(fā)現(xiàn)嫩葉同工酶在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)階段有相對(duì)穩(wěn)定性，適合用于馬藺同工酶分析樣品提取。通過(guò)進(jìn)一步酶譜統(tǒng)計(jì)，供試材料POD和EST共顯示出了22個(gè)不同酶帶，其中，有8條基本譜帶和4條特征譜帶，基本譜帶說(shuō)明11份材料具有遺傳上的同源性，一方面可以作為馬藺不同發(fā)育階段酶譜的識(shí)別標(biāo)志；另一方面，說(shuō)明不同生態(tài)地理位置生長(zhǎng)的馬藺具有親緣關(guān)系；而特征譜帶及不同位點(diǎn)的酶譜、酶活性等說(shuō)明種間存在明顯的差異，表明它們的異染色質(zhì)之間存在多態(tài)性。植物受到不同生境影響，遺傳分子水平發(fā)生變異，從而導(dǎo)致同工酶水平發(fā)生相應(yīng)的變異，而通過(guò)酶譜能識(shí)別控制這些譜帶所表達(dá)的基因，客觀上說(shuō)明了不同地理位置馬藺種質(zhì)材料的遺傳關(guān)系，利用過(guò)氧化物酶和酯酶酶譜分析作為一項(xiàng)鑒定指標(biāo)具有重要的應(yīng)用價(jià)值，為馬藺遺傳多樣性鑒定和育種等工作提供依據(jù)［20］。

表3 馬藺種質(zhì)材料營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段POD酶帶數(shù)及遷移率Table 3 Total POD bands and Rf value of Chinese Irisin vegetative and reproductive growth stages

3.2 馬藺不同生長(zhǎng)階段同工酶變化

在生物進(jìn)化中，同工酶為了適應(yīng)細(xì)胞代謝的多方面需求而產(chǎn)生，其在生理上表現(xiàn)為對(duì)代謝的調(diào)節(jié)作用［21］。當(dāng)一個(gè)酶受多個(gè)基因控制時(shí)，更容易適應(yīng)環(huán)境的變化，廣泛存在于植物體內(nèi)的過(guò)氧化物酶同工酶是植物體適應(yīng)環(huán)境變化并對(duì)變化做出靈敏反應(yīng)的一類酶，常被認(rèn)為是植物對(duì)環(huán)境抗逆性強(qiáng)弱的標(biāo)志。梁慧敏等［22］通過(guò)測(cè)定變溫處理情況下苜蓿不同器官過(guò)氧化物酶同工酶變化，指出溫度降低，苜蓿過(guò)氧化物酶同工酶酶活性增加，而與溫度上升呈明顯的負(fù)相關(guān)。酯酶是催化酯類化合物水解的酶系，它催化羧酸酯類的酯鍵的水解或合成，在植物不同的生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期表現(xiàn)出器官特異性和階段的特異性［6］。劉波等［23］通過(guò)酶電泳實(shí)驗(yàn)指出，不同居群半夏（Pinellia temate）不同酶系統(tǒng)中均有半夏物種的共同特征譜帶，同時(shí)又蘊(yùn)含著豐富的多態(tài)性。馬彥軍等［24］利用酶電泳技術(shù)研究不同濃度PEG處理尖葉胡枝子（Lespedeza hedysaroides）幼苗葉片同工酶及酶活性變化，說(shuō)明同工酶與作物抗旱性有一定關(guān)系，在水分脅迫后，葉片酶譜遷移率大小不同，說(shuō)明在不同逆境下出現(xiàn)了不同酶的基因表達(dá)。在植物的不同發(fā)育階段和不同器官組織中同工酶都具有特異性表現(xiàn)，其合成受到一系列基因的調(diào)控，常作為遺傳信息的指標(biāo)來(lái)研究植物的生長(zhǎng)發(fā)育和器官分化［25，26］。在對(duì)11份馬藺POD和EST分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同生長(zhǎng)階段的酶帶數(shù)和酶活性強(qiáng)弱差異較大，如營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段EST酶譜的酶活性較生殖生長(zhǎng)階段更強(qiáng)，酶譜表現(xiàn)也更清晰，而生殖生長(zhǎng)階段POD酶譜的酶活性較營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段更強(qiáng)，酶譜表現(xiàn)也較清晰。同丁玲等［10］采用過(guò)氧化物酶和酯酶分析了菊花營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)階段不同器官的同工酶變化相似，指出菊花的2個(gè)酶系統(tǒng)POD和EST分別在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段和生殖生長(zhǎng)階段清晰、分離好，具有多態(tài)性，隨著植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，植物組織或器官的生理特性和代謝過(guò)程發(fā)生深刻變化，同工酶也隨之變化。說(shuō)明不同種類植物體同工酶表現(xiàn)出組織特異性和發(fā)育階段特異性，可以利用同工酶電泳酶譜信息數(shù)據(jù)為馬藺遺傳多樣性提供生化水平分析的理論依據(jù)。

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