劉青海，姚 拓，馬 從，李顯剛

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

早在20世紀(jì)1925年就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)不同菌株組合混合培養(yǎng)可以形成不同的產(chǎn)物。研究認(rèn)為混合培養(yǎng)能減少或避免純培養(yǎng)過程中生物活性下降的現(xiàn)象，增加培養(yǎng)菌生物量［1］，可以獲得更多的菌株性質(zhì)。陶光燦等［2］研究了細(xì)菌組合的固氮，解磷與不同培養(yǎng)條件以及混合培養(yǎng)的研究表明，微生物之間存在著協(xié)同作用，這是一個(gè)潛能巨大的新的微生物資源，正在逐漸成為新的研究熱點(diǎn)。?；燮嫉龋?］對(duì)小麥根際的解磷菌、解鉀菌和固氮菌進(jìn)行了互作研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)兩菌株混合后，解磷菌P1616可以促進(jìn)固氮菌N2106－L生長(zhǎng)，提高了混合菌懸液中的細(xì)胞密度，解磷菌P1616還可以促進(jìn)解鉀菌KL0405的生長(zhǎng)。

溫度，pH和鹽分濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)影響很大，在微生物發(fā)酵的過程中要嚴(yán)格控制溫度，pH和鹽分濃度才能有最大的有效活菌數(shù)［4］。溶磷菌和固氮菌混合對(duì)溫度、pH和鹽分濃度等環(huán)境因素的響應(yīng)不同，本研究旨在確定混合菌株對(duì)環(huán)境因子的適應(yīng)范圍，為后續(xù)溶磷菌和固氮菌混合菌劑研制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

供試菌株為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草地微生物多樣性實(shí)驗(yàn)室提供的6株溶磷菌，4株固氮菌（表1）（3株聯(lián)合固氮菌和1株根瘤菌）。

表1 供試菌株及來源Table 1 List and source of tested strain

1.2 菌株間拮抗反應(yīng)

分別將活化后的菌株兩兩相交劃線接種在LB平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2～3d，每天觀察交叉點(diǎn)處細(xì)菌生長(zhǎng)狀況，若交叉點(diǎn)兩細(xì)菌生長(zhǎng)弱或不生長(zhǎng)，說明兩菌株間有拮抗作用，不適合混在一起做復(fù)合菌肥；若交叉點(diǎn)細(xì)菌生長(zhǎng)良好，則說明兩菌株可以共存，之間沒有抑制作用，不發(fā)生拮抗反應(yīng)的各菌株可以混合培養(yǎng)，可以做復(fù)合菌肥。

1.3 菌液的制備

將各供試菌株劃線接種于LB固體斜面上，28℃下培養(yǎng)24h，加滅菌水制成菌懸液，用UV－721紫外分光度計(jì)在D660nm下測(cè)定菌懸液濃度，并用無菌水調(diào)節(jié)D值一致后，備用。

1.4 菌株處理組合

A組 6株溶磷菌單獨(dú)培養(yǎng)（共計(jì)6個(gè)處理）；B組6株溶磷菌和4株固氮菌兩兩組合（共計(jì)24個(gè)處理）。

1.5 溫度條件對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

（1）將LB液體培養(yǎng)基分裝至試管中，每管5mL，121℃滅菌30min，備用。

（2）將菌株按0.1mL接種量接種到液體試管培養(yǎng)基，組合菌每個(gè)菌接種0.05mL，每個(gè)菌種組合接種3管，分別標(biāo)上10、15、20、25、30、35、40、45℃標(biāo)記。

（3）按標(biāo)記，將各試管置于相應(yīng)溫度的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。

（4）取出觀察各菌株的生長(zhǎng)情況，測(cè)定每個(gè)菌株的D660nm吸光值，并計(jì)算平均值，以確定各菌株的最適生長(zhǎng)溫度。

1.6 初始pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

（1）配置LB液體培養(yǎng)基，分裝為11份，分別采用1mol/L的NaOH和1mol/L的 HCl依次調(diào)節(jié)pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，再將LB液體培養(yǎng)基分裝至試管中，每管5mL，分別標(biāo)上pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0標(biāo)記，121℃滅菌30min，備用。

（2）將菌株菌懸液按0.1mL（單菌株）接種量接種到液體試管培養(yǎng)基，組合菌每個(gè)菌接種菌懸液0.05 mL（菌株組合），每個(gè)組合接種3管。

（3）將標(biāo)記好的菌株置于28℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，轉(zhuǎn)速為180r/min。

（4）取出觀察各菌株的生長(zhǎng)情況，并測(cè)定其D660nm的平均吸光值，確定菌株及組合的最適生長(zhǎng)pH。

1.7 鹽分對(duì)菌株生長(zhǎng)影響

在LB培養(yǎng)基中加入NaCl配成1%、3%、5%、7%、9%5個(gè)濃度梯度，滅菌后制成平板備用。將配好的各處理菌懸液以劃線法接種于各鹽濃度的LB固體培養(yǎng)基上，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，以不接種的為對(duì)照，置28℃下培養(yǎng)7d，觀察菌體生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗測(cè)定

拮抗試驗(yàn)是鑒定菌株間菌株菌能否共存的傳統(tǒng)方法，6株溶磷菌和4株固氮菌之間均無拮抗反應(yīng)發(fā)生，各菌種可以混合培養(yǎng)。

2.2 溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

由圖1～6可以看出，溫度對(duì)單菌株和混合菌的影響較大，各供試菌株在10～45℃均能生長(zhǎng)，但差異較顯著；各菌株或菌株組合從10～45℃的D660nm值先增加，到25℃或30℃時(shí)到達(dá)峰值，隨后開始下降，25～35℃是最佳培養(yǎng)溫度。

在圖1溶磷菌Jm170和根瘤菌S11組合接種在各溫度D660nm值低于單菌株Jm170和Jm170與其他固氮菌組合。在圖2～6中，Jx59＋G組合在10～45℃范圍內(nèi)D660nm值均高Jx59與其他固氮菌和根瘤菌的組合，當(dāng)30℃時(shí)到達(dá)峰值，為1.125；溶磷菌Lx81、Lx191、Jm92、Lx22與固氮菌和根瘤菌的組合的D660nm值在25～45℃均顯著高于Lx81單獨(dú)接菌時(shí)的D660nm值；在圖5，6中，Jm92＋W5和Lx22＋G是較優(yōu)菌株組合，在10～45℃D660nm值均高于其他組合，在10℃或45℃的條件下均能正常生活，Jm92＋W5在10℃和45℃條件下的D660nm值分別為0.268和0.278，Lx22＋G在10℃和45℃條件下的D660nm值分別為0.315和0.307，菌體數(shù)量較多，可以適應(yīng)高溫或低溫的不良環(huán)境。

2.3 初始pH對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

從圖7～12可看出，pH對(duì)單一菌株和混合菌的生長(zhǎng)影響較大，無論單一菌株或混合菌在pH＜4或＞9的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)緩慢或不生長(zhǎng)，pH在6.0～8.0，大部分菌或菌株組合都可以良好生長(zhǎng)，當(dāng)pH為8.5時(shí)，Lx191＋G和Lx191＋S11生長(zhǎng)最好，D660nm值分別為0.475、0.429。可以適應(yīng)較為堿性的土壤。

圖7中Jm170＋W5組合和Jm170＋G組合在pH為4.5～8.5的D660nm值顯著＞Jm170單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的D660nm值，Jm170和Jm170＋W5在pH為7.5時(shí)同時(shí)到達(dá)峰值，在峰值差異明顯，分別為0.482、0.728。在圖8中，Jx59是在pH為6.5時(shí)D660nm值達(dá)到峰值，而Jx59與固氮菌的組合在pH為7.5時(shí)D660nm值達(dá)到峰值。在圖10中，Lx81＋G在pH為6.5和7.5是D660nm值出現(xiàn)2個(gè)峰值，D660nm值分別0.655和0.705，均較Lx81在pH為6.5和7.5時(shí)的D660nm值0.369和0.512高。在圖10中，Lx191＋G、Lx191＋W5和Lx191＋N4等組合在pH 6.0～8.5的D660nm值顯著高于Lx191單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的D660nm值。在圖11中，Jm92＋S11組合在pH為8.0時(shí)D660nm值出現(xiàn)峰值，說明組合菌在堿性環(huán)境生長(zhǎng)更良好。在圖12中，pH在6.0～8.0時(shí)，溶磷菌Lx22與固氮菌的組合D660nm值顯著高于溶磷菌單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)D660nm值。圖7～12中，pH在6.0～8.0絕大多數(shù)菌和菌株組合生長(zhǎng)良好，菌株互作可以促進(jìn)菌株的生長(zhǎng)和繁殖。由于各菌株組合在偏堿性環(huán)境可以良好生長(zhǎng)，可以適應(yīng)北方的堿性的土壤，為菌肥的開發(fā)提高有利條件。

圖1 溫度對(duì)溶磷菌Jm170和固氮菌組合生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of temperature on the growth of mixed strains of PSB（Jm170）and NFB

圖2 溫度對(duì)溶磷菌Jx59和固氮菌組合生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of temperature on the growth of mixed strains of PSB（Jx59）and NFB

圖3 溫度對(duì)溶磷菌Lx81和固氮菌組合生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of temperature on the growth of mixed strains of PSB（Lx81）and NFB

圖4 溫度對(duì)溶磷菌Lx191和固氮菌組合生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of temperature on the growth of mixed strains of PSB（Lx191）and NFB

圖5 溫度對(duì)溶磷菌Jm92和固氮菌組合生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of temperature on the growth of mixed strains of PSB（Jm92）and NFB

圖6 溫度對(duì)溶磷菌Lx22和固氮菌組合生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effect of temperature on the growth of mixed strains of PSB（Lx22）and NFB

圖7 pH對(duì)溶磷菌Jm170和固氮菌組合生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effect of pH on the growth of mixed strains of PSB（Jm170）and NFB

圖8 pH對(duì)溶磷菌Jx59和固氮菌組合生長(zhǎng)的影響Fig.8 Effect of pH on the growth of mixed strains of PSB（Jx59）and NFB

圖9 pH對(duì)溶磷菌Lx81和固氮菌組合生長(zhǎng)的影響Fig.9 Effect of pH on the growth of mixed strains of PSB（Lx81）and NFB

圖10 pH對(duì)溶磷菌Lx191和固氮菌組合生長(zhǎng)的影響Fig.10 Effect of pH on the growth of mixed strains of PSB（Lx191）and NFB

圖11 pH對(duì)溶磷菌Jm92和固氮菌組合生長(zhǎng)的影響Fig.11 Effect of pH on the growth of mixed strains of PSB（Jm92）and NFB

圖12 pH對(duì)溶磷菌Lx22和固氮菌組合生長(zhǎng)的影響Fig.12 Effect of pH on the growth of mixed strains of PSB（Lx22）and NFB

2.4 鹽分對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，不論單一菌株還是菌株組合均能在1%NaCl的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，隨鹽分濃度的升高，菌株及菌株組合或能生長(zhǎng)或生長(zhǎng)一般或生長(zhǎng)良好。但在9%NaCl濃度下，各處理均不能生長(zhǎng)。在3%NaCl濃度下，溶磷菌只有Lx81能良好生長(zhǎng)，其他菌都生長(zhǎng)一般，菌株組合中Jm170＋W5、Jx59＋W5、Jx59＋G、Lx81＋W5、Lx81＋G、Lx191＋W5、Jm92＋N4和Lx22＋G等7個(gè)組合能生長(zhǎng)良好，比單一菌株生長(zhǎng)好。在5%NaCl濃度下，組合中只有Lx191＋W5能良好生長(zhǎng)，而Jm170＋S11、Jx59＋N4、Jm92、Lx22＋S11不能生長(zhǎng)，Jm170、Jm170＋W5、Lx81、Lx81＋G、Lx191＋G生長(zhǎng)一般，其他菌株組合生長(zhǎng)較差。在7%NaCl濃度下，單一菌株中只有Jm170、Jx59生長(zhǎng)較差，其他單一菌株均不能生長(zhǎng)，而組合菌中Lx81＋W5、Lx191＋W5、Jm92＋W5生長(zhǎng)一般，Jm170＋W5、Jm170＋N4、Lx81＋N4、Lx81＋G、Jm92＋N4、Jm92＋G、Lx22＋W5、Lx22＋G可以生長(zhǎng)，比它們單獨(dú)培養(yǎng)耐鹽性強(qiáng)。菌株互作可以促生菌的耐鹽性，大部分菌株組合都可以耐受7%NaCl濃度，有較強(qiáng)的耐鹽性，對(duì)甘肅鹽堿性土壤條件具有一定的適應(yīng)性，有利于開發(fā)適宜甘肅省的微生物促生菌劑（表2）。

表2 不同鹽分濃度對(duì)各菌株及其組合生長(zhǎng)的影響Table 2 The effect of different salt concentrations on strains and combinations

3 討論與結(jié)論

3.1 溫度條件對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

溫度是影響生物有機(jī)體生長(zhǎng)和存活最重要的因素，它可以從不同的方面對(duì)生物體內(nèi)所進(jìn)行的許多生物化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生影響［5］，溶磷菌與固氮菌或根瘤菌混合培養(yǎng)后在5～45℃均可正常有活，菌株組合Jm92＋W5，Jm92＋N4、Jm92＋S11和Jm92＋G在任何溫度下D660nm值都顯著高于Jm92單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)D660nm值，菌株組合可以提高培養(yǎng)液中的活菌數(shù)，尤其是溶磷菌和固氮菌或根瘤菌組合表現(xiàn)的尤為突出，固氮菌或根瘤菌能固定空氣中的氮，可以提高溶液的含氮量，為溶磷菌生長(zhǎng)提供更多的氮素，溶磷菌與固氮菌組合可能分泌一些激素來促進(jìn)他們各自的生長(zhǎng)。溫度主要影響菌株體內(nèi)酶的活性，在低溫時(shí)，酶活性較低，酶促反應(yīng)也較緩慢，利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能力也較弱，從而影響細(xì)菌的生長(zhǎng)，隨著溫度的升高，酶活性也逐漸升高，酶促反應(yīng)也較快，加快了對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率、細(xì)菌的分化速度，從而提供了培養(yǎng)液中的活菌數(shù)，但溫度上升到一定程度，如超過35℃時(shí)，許多酶逐漸失活，酶促反應(yīng)也開始降低，降低了對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率，細(xì)菌數(shù)量大量減少，當(dāng)超過45℃時(shí)，大批的酶失活，菌體不能利用溶液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而細(xì)菌大批死亡，溶液中的細(xì)菌數(shù)量達(dá)到最低值；溫度還會(huì)通過影響發(fā)酵液的理化性質(zhì)，間接影響菌體生長(zhǎng)［6，7］。許多研究表明，細(xì)菌的溫度培養(yǎng)控制在28～30℃比較適合［8］，但試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，溶磷菌與固氮菌或根瘤菌組合培養(yǎng)時(shí)，溫度在25～35℃，培養(yǎng)液的菌數(shù)均可達(dá)到較高水平，從而放寬了菌肥發(fā)酵時(shí)的溫度范圍，為菌肥的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

3.2 初始pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

培養(yǎng)液中不同初始pH對(duì)菌體產(chǎn)量影響較大，在pH＞4或＜9的培養(yǎng)液中均不能正常生長(zhǎng)，培養(yǎng)液中的pH將影響到細(xì)菌對(duì)代謝產(chǎn)物的解離，引起細(xì)胞膜電荷變化，從而影響對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，pH還影響細(xì)菌體內(nèi)酶的合成，進(jìn)而影響細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解利用［9］。pH過高或過低都不利于細(xì)菌的生長(zhǎng)和代謝物質(zhì)的產(chǎn)生，進(jìn)而影響到溶磷菌、固氮菌的溶磷能力、產(chǎn)激素能力和固氮能力。鐘傳青［10］發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)時(shí)pH在7～8菌體數(shù)最多，當(dāng)pH低于7或高于8時(shí)，菌體產(chǎn)量下降，因此，初始pH值在7～8較適合。湯春梅等［4］發(fā)現(xiàn)燕麥或小麥根際促生菌在中性或偏堿的條件下生長(zhǎng)好，178、O－6、N4和X5對(duì)堿性環(huán)境適應(yīng)性很強(qiáng)。胡子全等［11］發(fā)現(xiàn)一株有機(jī)磷細(xì)菌最適初始pH為8.0～9.0，在初始pH為5.5～10.0內(nèi)時(shí)，pH對(duì)有機(jī)磷細(xì)菌生長(zhǎng)影響不顯著。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)混合菌均較單一菌對(duì)pH值的耐受范圍大，Jm92＋G在初始pH為5.0～8.5菌能正常生長(zhǎng)，活菌數(shù)較多，可以適應(yīng)偏堿或偏酸的環(huán)境，提高了菌肥的生態(tài)適應(yīng)性，混合菌對(duì)pH適應(yīng)范圍增大，可能是由于產(chǎn)酸菌或產(chǎn)堿菌的存在，所產(chǎn)的酸或堿緩沖了溶液pH對(duì)菌體的傷害，從而增大了對(duì)pH的適應(yīng)范圍。試驗(yàn)溶磷菌和固氮菌組合，無論單一菌或混合菌均能在pH為8的堿性環(huán)境正常生長(zhǎng)，可以適應(yīng)北方鹽堿性的土壤，這為菌肥的開發(fā)提供了有利條件。

3.3 鹽分對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

Na＋和Cl－是維持細(xì)胞外液滲透壓的主要離子；在細(xì)胞外液的陽離子總量中，Na＋占90%以上，在陰離子總量中，Cl－占70%。所以，NaCl在維持滲透壓方面起著重要作用。Na＋與細(xì)胞膜成分發(fā)生特異作用而增強(qiáng)了膜的機(jī)械強(qiáng)度，有利于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。高鹽條件下，引起菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)中的核質(zhì)都變的更緊密，多核糖體的比例不斷上升［11］。不同的NaCl濃度下，細(xì)菌中的細(xì)胞脂肪酸的組成也不同，高鹽濃度下，細(xì)胞的脂肪酸含量不斷上升，達(dá)到一定濃度不再上升，當(dāng)鹽濃度繼續(xù)增加時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞便會(huì)發(fā)生質(zhì)壁分離，細(xì)菌細(xì)胞脫水死亡［13］。

細(xì)菌的耐鹽機(jī)理較復(fù)雜，大部分人認(rèn)為細(xì)菌可以合成或積累一些所謂“親合性溶質(zhì)”的有機(jī)化合物，如甘油、單糖、氨基酸及其衍生物等小分子極性物質(zhì)來平衡細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓，保護(hù)由于脫水而變性的蛋白質(zhì)［14］。這些親和性有機(jī)化合物在細(xì)菌體內(nèi)迅速合成和分解，對(duì)于不同的鹽環(huán)境有很好的適應(yīng)作用。

在低鹽濃度下，各菌株和菌株組合都能良好生長(zhǎng)，當(dāng)7%NaCl濃度下，Jm170、Jx59、W5生長(zhǎng)較差，而組合菌株中，Lx81＋W5、Lx191＋W5、Jm92＋W5生長(zhǎng)一般，Jm170＋W5、Jm170＋N4、Lx81＋N4、Lx81＋G、Jm92＋N4、Jm92＋G可以生長(zhǎng)，較單獨(dú)培養(yǎng)菌株耐鹽性強(qiáng)。混合培養(yǎng)耐鹽性增強(qiáng)可能是由于兩菌株混合（溶磷菌和固氮菌）能夠使小分子極性物質(zhì)，如甘油、單糖、氨基酸抵抗高濃度鹽對(duì)細(xì)胞的損傷，可以從細(xì)胞外高鹽環(huán)境中獲取更多的水分，從而混合菌具有更強(qiáng)的耐鹽性，具體機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。組合菌的耐鹽性對(duì)西北地區(qū)鹽堿性土壤有一定適應(yīng)性，對(duì)于開發(fā)適宜西北地區(qū)的PGPR混合菌肥有重要意義。

溶磷菌和固氮菌單獨(dú)培養(yǎng)或混合培養(yǎng)最適溫度在25～35℃，混合培養(yǎng)較單獨(dú)培養(yǎng)生長(zhǎng)良好；溶磷菌和固氮菌單獨(dú)培養(yǎng)或混合培養(yǎng)最適pH在6.5～7.5，在pH 7.5～8.5偏堿性環(huán)境下，混合培養(yǎng)生長(zhǎng)較好，較單獨(dú)培養(yǎng)耐堿性更強(qiáng)；菌株Lx81＋W5組合，Lx191＋W5組合和Jm92＋W5組合可以在7%的鹽濃度下正常生長(zhǎng)，較單獨(dú)培養(yǎng)表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐鹽性。

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