洪遜強(qiáng) 楊 柳 劉利利 潘恩山 南方醫(yī)科大學(xué)中西結(jié)合醫(yī)院皮膚科(廣州 510315)

色素障礙性皮膚病易診難治,目前臨床上尚缺乏較有效的治療方案,對(duì)其機(jī)理仍不十分清楚。中醫(yī)在長(zhǎng)期醫(yī)療實(shí)踐中積累了“以白治黑,以黑治白”的臨床經(jīng)驗(yàn)。2007年以來,我們對(duì)中藥色象理論形成的背景及研究意義多次在全國中西醫(yī)結(jié)合、中醫(yī)及中西醫(yī)結(jié)合皮膚病專業(yè)學(xué)術(shù)會(huì)議進(jìn)行交流[1～3],首次將這種表明藥材顏色與療效相關(guān)的現(xiàn)象,稱之為“中藥色象”。將這種治療色素病色效相關(guān)的中藥,稱之為“色象中藥”。本研究通過查閱大量的文獻(xiàn)資料及臨床資料,篩選出中醫(yī)傳統(tǒng)治驗(yàn)及現(xiàn)代研究表明治療色素病有效的黑白兩類中藥各 10種,研究色象中藥對(duì)黑素細(xì)胞增殖及黑素合成的影響,探討色象中藥與色素代謝的相關(guān)性,為色象理論及臨床辨證用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 黑素瘤細(xì)胞株來源 人 A375黑素瘤細(xì)胞株由中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)中藥 包括制首烏、熟地、女貞子、菟絲子、補(bǔ)骨脂、紅花、丹參、雞血藤、墨旱蓮、益母草、白茯苓、白術(shù)、白蒺藜、白及、白芷、桃仁、當(dāng)歸、山藥、白芍、薏苡仁,購自南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院中藥房,經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)系中藥炮制教研室鑒定。

1.3 試劑 M T T(四甲基偶氮唑藍(lán))、二甲基亞砜(DMSO)、0.25%胰蛋白酶-EDT A(美國 Sigma公司),DMEM培養(yǎng)液(高糖)、10%胎牛血清(美國 Gibco公司),其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 主要儀器 倒置顯微鏡(Nikon公司),自動(dòng)酶標(biāo)儀(芬蘭 Thermo公司 )等。

2 方 法

2.1 實(shí)驗(yàn)藥物分組 依據(jù)飲片的外在顏色分為黑白兩組,每組各選 10味藥作為代表藥 ,①黑 (深 )色組 (制首烏、熟地、女貞子、菟絲子、補(bǔ)骨脂、紅花、丹參、雞血藤、墨旱蓮、益母草 );②白(淺)色組(白茯苓、白術(shù)、白蒺藜、白及、白芷、桃仁、當(dāng)歸、山藥、白芍、薏苡仁)。

2.2 中藥藥液的制備 分別稱取上述 20味中藥,單味藥物飲片經(jīng)鑒定后置砂鍋中,加相當(dāng)于藥材量的 8倍的蒸餾水浸泡 2h,煮沸 30min過濾。藥渣加 5倍水繼續(xù)煎煮,煮沸 30min過濾。合并兩次濾液,于水浴上分別進(jìn)行濃縮 ,用不含胎牛血清培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋,使藥物終質(zhì)量濃度為 20μg/mL、10μg/mL、5μ g/mL,儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 黑素瘤細(xì)胞增殖的測(cè)定[4]采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(M TT法),細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)后,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞常規(guī)消化 ,調(diào)整細(xì)胞為 5× 104個(gè) /mL,取 100 μl接種于 96孔板,37℃及 5% CO2下孵育 24h后,每孔加入 100μl不含胎牛血清培養(yǎng)基稀釋好的中藥,使藥物終質(zhì)量濃度為 20 μg/mL、10 μg/mL、5μ g/mL,每個(gè)濃度設(shè) 3個(gè)復(fù)孔,并設(shè)對(duì)照組:單純培養(yǎng)基組、中藥對(duì)照組(培養(yǎng)基+中藥 )和空白對(duì)照組(培養(yǎng)基+細(xì)胞),置于孵箱中作用 48h后,棄上清液,用不含 Ca2+和 Mg2+的 PBS液洗 2遍,每孔加入 5g/L的 M T T溶液 20μl,于 37℃及 5%CO2下孵育下 4h,棄上清液,每孔加 150μl DM SO,振蕩 10min,在酶標(biāo)儀 490nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔吸光度值(OD值),每組重復(fù) 3次,取平均值。用吸光度值表示細(xì)胞增殖。細(xì)胞增殖=實(shí)驗(yàn)組的吸光度值 中藥對(duì)照組的吸光度值;空白對(duì)照組細(xì)胞增殖=空白對(duì)照組的吸光度值 單純培養(yǎng)基對(duì)照組的吸光度值。

2.4 黑素合成含量測(cè)定[5,6]NaOH裂解法,黑素細(xì)胞接種方法同上,設(shè)立對(duì)照組同前。藥物作用 48h后,棄上清液,用不含 Ca2+和 Mg2+的 PBS液洗 2遍,然后加入 100μL1N NaOH(含 10%DM SO)在 37℃水浴保溫 2h,用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm波長(zhǎng)的吸光度值,每組重復(fù) 3次,取平均值。用吸光度值表示黑素含量,黑素含量=實(shí)驗(yàn)組的吸光度值 中藥對(duì)照組的吸光度值;空白對(duì)照組黑素含量=空白對(duì)照組的吸光度值 單純培養(yǎng)基對(duì)照組的吸光度值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

3 結(jié) 果

3.1 實(shí)驗(yàn)中藥對(duì)黑素瘤細(xì)胞增殖的影響 如表 1、表 2。結(jié)果表明:黑色組藥物中除益母草外,其余 9種對(duì)黑素細(xì)胞增殖均有促進(jìn)作用,與空白對(duì)照組相比,差異均有顯著性(P＜0.05或 P＜0.01);白色組藥物中除桃仁、薏苡仁、山藥外,其余 7種對(duì)黑素細(xì)胞增殖均有明顯抑制作用,差異均有顯著性(P＜0.05或 P＜0.01)。另外 ,研究發(fā)現(xiàn)白蒺藜、白芷、白茯苓、白芍、熟地這五味藥物具有雙向調(diào)節(jié)作用,而桃仁雖為白色,但卻起著促進(jìn)作用。益母草、薏苡仁、山藥與空白對(duì)照組相比,差異均無顯著性(P＞ 0.05)。

表1 黑色組中藥對(duì)細(xì)胞增殖的影響(±s)

表1 黑色組中藥對(duì)細(xì)胞增殖的影響(±s)

與空白對(duì)照組比較:△P＜0.05,▲P ＜0.01

不同濃度藥物作用48h后OD值中 藥5 μg/mL 10μ g/mL 20 μg/mL空白對(duì)照組OD值制首烏 0.5327±0.0448 0.5826±0.0189▲ 0.6366± 0.0146▲ 0.4961±0.0174熟 地 0.4432±0.02581△ 0.5476±0.0283 0.5754± 0.0368△ 0.4961±0.0174女貞子 0.5004± 0.0192 0.5273± 0.0150 0.5337± 0.0246△ 0.4961± 0.0174補(bǔ)骨脂 0.5696±0.0318△ 0.5881±0.0577△ 0.6112± 0.0175▲ 0.4961±0.0174紅 花 0.5153±0.0274 0.5481±0.0263△ 0.5748± 0.0251▲ 0.4961±0.0174菟絲子 0.5733±0.0302△ 0.5772±0.0335△ 0.6071± 0.0229▲ 0.4961±0.0174丹 參 0.5703±0.0385△ 0.5989±0.0315▲ 0.6354±0.0185▲ 0.4961±0.0174雞血藤 0.5726±0.0269▲ 0.5856±0.0260▲ 0.6336± 0.0303▲ 0.4961±0.0174墨旱蓮 0.5582± 0.0322△ 0.5271± 0.0265 0.5085± 0.0282 0.4961± 0.0174益母草 0.5080± 0.0237 0.5192± 0.0383 0.5257± 0.0263 0.4961± 0.0174

表2 白色組中藥對(duì)細(xì)胞增殖的影響(±s)

表2 白色組中藥對(duì)細(xì)胞增殖的影響(±s)

與空白對(duì)照組比較:△P＜0.05,▲P ＜0.01

不同濃度藥物作用48h后OD值中 藥5 μg/mL 10μ g/mL 20 μg/mL空白對(duì)照組OD值山 藥 0.4902± 0.0174 0.4810± 0.0253 0.4663± 0.0235 0.4961± 0.0174白 術(shù) 0.4727±0.0295 0.4525±0.0178△ 0.4482± 0.0169△ 0.4961±0.0174白蒺藜 0.4277±0.0203▲ 0.4516±0.0086△ 0.5404± 0.0375△ 0.4961±0.0174白 及 0.4633±0.0233 0.4503±0.0193△ 0.4433± 0.0178△ 0.4961±0.0174桃 仁 0.4972± 0.0215 0.5235±0.0234 0.5425± 0.0175△ 0.4961± 0.0174白 芷 0.4272±0.0191▲ 0.4487±0.0152△ 0.5348±0.0238△ 0.4961±0.0174當(dāng) 歸 0.4734±0.0094 0.4606±0.0135△ 0.4529± 0.0200▲ 0.4961±0.0174白茯苓 0.5448±0.0223△ 0.4912±0.0152 0.4156± 0.0248▲ 0.4961±0.0174白 芍 0.5335±0.0177△ 0.4950±0.0134 0.4616± 0.0140△ 0.4961±0.0174薏苡仁 0.4968± 0.0306 0.4717± 0.0174 0.4848± 0.0254 0.4961± 0.0174

3.2 實(shí)驗(yàn)中藥對(duì)黑素含量的影響 如表 3、表 4。結(jié)果表明:黑色組藥物中除益母草外,其余 9種對(duì)黑素細(xì)胞合成均有促進(jìn)作用,與空白對(duì)照組相比較,差異均有顯著性(P＜0.05或P＜0.01);白色組藥物中除桃仁、薏苡仁外,其余 8種對(duì)黑素細(xì)胞增殖均有明顯抑制作用,與空白對(duì)照組比較,差異均有顯著性(P＜0.05或 P＜0.01)。另外,白蒺藜、白芷、白茯苓、白芍、熟地這五味藥物具有雙向調(diào)節(jié)作用,而桃仁雖為白色,但卻起著促進(jìn)作用。益母草、薏苡仁與空白對(duì)照組相比,差異均無顯著性(P＞ 0.05)。

表3 黑色組中藥對(duì)黑素含量的影響(±s)

表3 黑色組中藥對(duì)黑素含量的影響(±s)

與空白對(duì)照組比較:△P＜0.05,▲P ＜0.01

不同濃度藥物作用48h后OD值中 藥5 μg/mL 10μ g/mL 20 μg/mL空白對(duì)照組OD值制首烏 0.4500± 0.0279 0.4644± 0.0267 0.4897± 0.0108△ 0.4265± 0.0359熟 地 0.3721±0.0265△ 0.4528±0.0234 0.4982± 0.0254△ 0.4265±0.0359女貞子 0.4349± 0.0276 0.4614± 0.0363 0.4908± 0.0183△ 0.4265± 0.0359補(bǔ)骨脂 0.4462±0.0216 0.4746±0.0242△ 0.5048± 0.0152▲ 0.4265±0.0359紅 花 0.4374±0.0291 0.4828±0.0297△ 0.5014± 0.0182△ 0.4265±0.0359菟絲子 0.4842±0.0163△ 0.5016±0.0288▲ 0.5252± 0.0245▲ 0.4265±0.0359丹 參 0.5132±0.0208▲ 0.5339±0.0242▲ 0.5688±0.0303▲ 0.4265±0.0359雞血藤 0.5216±0.0289▲ 0.5688±0.0369▲ 0.6271± 0.0360▲ 0.4265±0.0359墨旱蓮 0.5022± 0.0337△ 0.4406± 0.0342 0.4515± 0.0399 0.4265± 0.0359益母草 0.4415± 0.0387 0.4475± 0.0226 0.4682± 0.0162 0.4265± 0.0359

表4 白色組中藥對(duì)黑素含量的影響(±s)

表4 白色組中藥對(duì)黑素含量的影響(±s)

與空白對(duì)照組比較:△P＜0.05,▲P ＜0.01

中 藥不同濃度藥物作用48h后OD值5 μg/mL 10μ g/mL 20 μg/mL空白對(duì)照組OD值山 藥 0.4156± 0.0152 0.3921±0.0084 0.3736± 0.0254△ 0.4265± 0.0359白 術(shù) 0.4189±0.0119 0.3728±0.0268△ 0.3580± 0.0259△ 0.4265±0.0359白蒺藜 0.3178±0.0183▲ 0.3662±0.0183△ 0.4854± 0.0366△ 0.4265±0.0359白 及 0.4034±0.0108 0.3653±0.0273△ 0.3378± 0.0180▲ 0.4265±0.0359桃 仁 0.4409±0.0210 0.4840±0.0220△ 0.5000± 0.0338△ 0.4265±0.0359白 芷 0.3063±0.0165▲ 0.3824±0.0120 0.4845± 0.0342△ 0.4265±0.0359當(dāng) 歸 0.4059± 0.0200 0.3877±0.0207 0.3510± 0.0267△ 0.4265± 0.0359白茯苓 0.4891±0.0348△ 0.3789±0.0242 0.2972± 0.0179▲ 0.4265±0.0359白 芍 0.4890±0.0390△ 0.3674±0.0223△ 0.3525±0.0189△ 0.4265±0.0359薏苡仁 0.4186± 0.0139 0.4145± 0.0160 0.4150± 0.0221 0.4265± 0.0359

4 討 論 中醫(yī)在長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中積累了應(yīng)用白色藥物 (如白芷、白附子、白茯苓等)治療色素沉著類皮膚病 ,應(yīng)用黑色藥物 (如首烏、熟地、黑芝麻等)治療色素減退類皮膚病的治療經(jīng)驗(yàn)。近年來,國內(nèi)已經(jīng)有更多的同行注意到了藥材本身顏色與藥效的關(guān)系,如湖南中醫(yī)藥大學(xué)歐陽恒教授[7]總結(jié)此類以白治黑,以黑治白之法為“以色治色法”,研創(chuàng)紫銅消白方(主要由紫銅、丹參、紫草、紅花等多味紫紅色藥材組成)治療白癜風(fēng)取得較好臨床療效而獲 1994年度國家中醫(yī)藥管理局科技進(jìn)步獎(jiǎng)。楊志波[8]對(duì)“以色治色法”治療色素障礙性皮膚病進(jìn)行初步研究,認(rèn)為顏色深的藥物可能含有較多的增色物質(zhì),這些物質(zhì)能促進(jìn)黑素細(xì)胞的增殖以及酪氨酸酶的活性,從而促進(jìn)黑色素的合成;顏色淡的藥物中可能含有較多的褪色物質(zhì),這些物質(zhì)能抑制黑素胞的增殖以及酪氨酸酶的活性。另外,許愛娥[9]等將對(duì)酪氨酸酶激活率較高的墨旱蓮、無花果、沙苑子 3種中藥加入活性碳脫色處理后,發(fā)現(xiàn) 3種中藥均不能再激活酪氨酸酶,提示中藥的色素與酪氨酸酶的活性具有一定的相關(guān)性。

本研究從新的角度出發(fā),運(yùn)用新的理論假說,探討中藥對(duì)細(xì)胞增殖及黑素合成的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑色或深色類藥物促進(jìn)細(xì)胞增殖及黑素合成的作用更明顯,而白色或淺色類藥物的抑制作用更明顯。說明藥材顏色與色素代謝調(diào)節(jié)存在一定的相關(guān)性,為臨床應(yīng)用中藥治療色素代謝障礙性疾病用藥提供了較科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí),研究還發(fā)現(xiàn)并非所有藥物都具有這一特性,部分藥物具有雙向調(diào)節(jié)作用,少數(shù)藥物具有相反調(diào)節(jié)作用或者無調(diào)節(jié)作用,而白蒺藜的雙向調(diào)節(jié)作用與我們以往的研究結(jié)果[10-11]一致。另外,有些藥物的作用與以往報(bào)道略有不同或相反,這可能與藥物產(chǎn)地、炮制加工方法、藥物濃度以及實(shí)驗(yàn)條件不同等諸多因素有關(guān)。綜合我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,提示臨床上應(yīng)用色象理論指導(dǎo)治療色素沉著性皮膚病(黃褐斑)或色素脫失性皮膚病(白癜風(fēng))是可行的,針對(duì)不同的疾病其用藥應(yīng)有所不同,前者宜多用淺色類藥物治療,后者宜多用深色類藥物治療。當(dāng)然,把藥物進(jìn)行脫色處理后對(duì)細(xì)胞增殖及黑素合成有無調(diào)節(jié)作用?中藥的顏色種類繁多,如何進(jìn)行合理歸類?不同顏色配伍對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響如何?實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床療效的關(guān)系等問題都有待更深入的研究。

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