劉玉燕,杜金鴻,陳 果,王佺珍,崔 健

(1.西北農林科技大學動物科技學院草業(yè)科學系，陜西 楊凌 712100；2.西北農林科技大學生命科學學院植物科學系，陜西 楊凌 712100)

菊苣(Cichoriumintybus)是菊科菊苣屬多年生草本植物，可藥食兼用，食用主要體現(xiàn)為優(yōu)質牧草，許多家畜喜食[1]，而菊苣藥效功能的研究有抑制腫瘤[2]、消炎[3]和保肝作用[4]等。美國食品及藥物管理局普遍認為菊苣提取物是安全的[5]。超聲波提取方法應用廣泛，是快速提取的有效方法之一[6]。影響超聲波提取的主要因素有功率、頻率、溫度和時間，加之試驗中的其他因素，較難掌握各因素作用大小或重要性，因此需進行條件優(yōu)化[7]。正交設計包含多種因素，能優(yōu)化整體過程而不影響結果[8]，而且還可以減少不穩(wěn)定的所有內在因素[9]。

植物源農藥的有效成分是自然存在的，易于降解，在環(huán)境中積累毒性的可能性不大，是對人和動物毒性比較低，對生態(tài)環(huán)境影響小的安全農藥[10]。農田雜草生長和繁衍迅速，嚴重影響作物的產(chǎn)量，故天然除草劑是開發(fā)植物源農藥的重要內容之一[11]。菊苣應用廣泛且藥效功能多樣，但是鮮見有關開發(fā)菊苣提取物植物源農藥的研究報道。本研究的目的是利用無毒的水和低毒的乙醇配制成不同體積分數(shù)的乙醇溶液作為溶劑，結合超聲波輔助提取，對菊苣根粗提物的提取條件進行優(yōu)化，排序各因素影響的重要性；觀測菊苣根粗提物的除草活性，開發(fā)菊苣植物源除草劑。

1 材料與方法

1.1材料 2009年9月新鮮收獲5年齡普那菊苣根，采樣地點在陜西楊凌西北農林科技大學試驗地，菊苣根清洗干凈，切成3～5 mm薄片，置于50℃烘箱中烘烤至質量恒定[6]，粉碎，過40目篩(顆粒直徑小于0.35 mm)[12-13]，菊苣根干粉放入密封袋中保存。稗草(Echinochloacrusgali)種子是2008年收集于田埂邊或路邊，野生種；反枝莧(Amaranthusretroflexus)種子是2009年收集于西北農林科技大學草業(yè)科學系試驗田，栽培品種。無水乙醇和蒸餾水由西北農林科技大學后勤集團試驗材料供應部提供。

1.2儀器 電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9140A)，中草藥粉碎機(FW177)，NC超聲波發(fā)生器(KQ-500DE)，旋轉蒸發(fā)器(RE52-98A)，循環(huán)水式多用真空泵(SHB-Ⅲ)，AY220電子分析天枰，YP1200電子天平，智能植物培養(yǎng)箱(ZPW-400)。

1.3試驗設計 觀察乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲溫度、浸泡時間、浸泡重復次數(shù)、超聲時間、超聲輸入功率和超聲重復次數(shù)8個因素對超聲波輔助提取的影響(除頻率外，因為本試驗考察都是單因素，而文獻報道超聲雙頻或變頻對提取效果更好[14]，因此頻率不在本試驗考察范圍內)，前3個因素各有4個水平，即乙醇體積分數(shù)(因素A)分別是0、50%、75%和100%；料液比(g/mL，因素B)分別為1∶8、1∶16、1∶24和1∶32；超聲溫度(因素C)分別為20℃(功率高時用冰塊維持水溫)、35℃、 50℃和65℃。剩下的因素均分成2個水平，包括乙醇溶液浸泡時間(因素D)24或48 h；浸泡重復次數(shù)(因素E)1次或2次，其中浸泡2次時，即收集濾液，濾渣重復操作一次；超聲時間(因素F)30或120 min；超聲輸入功率(因素G)200或400 W；以及超聲重復次數(shù)(因素H)1次或2次。8個因素及其水平等級分配見表1，第J列是為空列準備的，用于解釋正交法的誤差統(tǒng)計[15]。

表1 混合正交L16(43×26)因素位級

1.4菊苣根粗提物制備 根據(jù)正交矩陣L16(43×26)，試驗將進行16種不同處理(表2)，每次取250 g菊苣根粉末(過40目篩)分配于數(shù)個1 000 mL廣口瓶中，加相應體積分數(shù)的乙醇溶液并用玻棒攪拌，室溫浸泡。超聲重復2次，第1次在整個浸泡時間的中點處中斷。超聲后過濾混合液，收集濾液于40℃旋轉蒸發(fā)儀上濃縮至浸膏狀[16]，計算提取率：

1.5除草活性測定 配制5個不同梯度的菊苣根粗提物溶液，測定不同質量濃度下菊苣根粗提物對稗草和反枝莧的發(fā)芽抑制作用，質量濃度依次為40.5、13.5、4.5、1.5和0.5 g/L[17]。除草劑2,4-二氯基苯氧酸(2,4-D)用作陽性對照組，其質量濃度為1 g/L[18]，蒸餾水作空白對照組(以下簡稱對照組)。

稗草和反枝莧種子均剔除雜物和其他草種，15%的次氯酸鈉溶液表面消毒20 min后[18]，立即用無菌蒸餾水沖洗數(shù)遍。隨機取10粒種子[17]均勻擺放在附2層濾紙[19-20]的培養(yǎng)皿中(Φ 9 cm)，16種處理的每一濃度設4個重復。綜合Seal等[17]和Kordali等[20]的方法，反枝莧每皿添加溶液6 mL，稗草8 mL，陽性對照組和對照組分別加相應體積的2,4-D 溶液和蒸餾水。種子置于(25±2)℃[21]，光照12 h，濕度80%[18]的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。反枝莧發(fā)芽比稗草迅速，因此，前者觀察5 d[21]，后者觀察7 d[22]。記錄每天的發(fā)芽個數(shù)，雜草的萌發(fā)指數(shù)[23]:

式中，Dt為發(fā)芽時間(d)；Gt為與Dt相對應的每天發(fā)芽種子數(shù)。菊苣根粗提物對雜草的抑制率[18]:

1.6數(shù)據(jù)分析 使用Excel 2003、SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1超聲波輔助對菊苣根提取的工藝優(yōu)化 菊苣根粗提物的16個提取率列于表2，根據(jù)正交試驗分析方法[15]計算各水平提取率之和、和極差，得出最優(yōu)條件和各因素的重要性次序，方差分析各因素的影響差異性(表3)。空列(J)極差為0.5，約占除J之外第2小極差(F)的7.24%和第3小極差(B)的4.42%(<5%)，說明試驗在允許誤差范圍之內，結果得出提取的最優(yōu)條件組合為乙醇體積分數(shù)0，料液比1∶8，超聲溫度65℃，浸泡24 h，浸泡重復2次，超聲30 min，超聲輸入功率400 W和超聲重復2次；8個因素的重要性次序，按遞減順序是：乙醇體積分數(shù)、浸泡重復次數(shù)、超聲輸入功率、浸泡時間、超聲重復次數(shù)、超聲溫度、料液比、超聲時間；各因素對菊苣根提取率的影響均差異顯著(P<0.05)，其中乙醇體積分數(shù)、浸泡時間、浸泡重復次數(shù)，超聲輸入功率和超聲重復次數(shù)對菊苣提取率的影響極顯著(P<0.01)。

表2 矩陣L16(43×26)對試驗因素和水平的分配及結果(提取率)

表3 8個因素的條件優(yōu)化、重要性次序和方差分析結果

2.2菊苣根粗提物對稗草萌發(fā)指數(shù)的影響 菊苣根粗提物對稗草萌發(fā)指數(shù)抑制率的影響見表4。22.9%是菊苣根粗提物對稗草抑制率顯著性的標記(表中以粗黑體顯示)，抑制率高于22.9%表明其抑制作用顯著(P<0.05)，故16種處理的菊苣根粗提物對稗草萌發(fā)指數(shù)均有抑制作用。抑制作用對菊苣根粗提物的質量濃度有依賴性，不同質量濃度下菊苣根粗提物的抑制效果分別是：40.5 g/L時16種處理的抑制率均高于對應組的其他質量濃度；13.5 g/L時各處理的抑制作用顯著(P<0.05)；4.5、1.5和0.5 g/L時除少數(shù)抑制作用不顯著外，其他均抑制顯著(P<0.05)。菊苣根粗提物40.5 g/L時，除T5、T9、T11和T14外，其他均與2,4-D差異不顯著(P>0.05)，表明菊苣根粗提物在該質量濃度下顯著抑制稗草發(fā)芽。

2.3菊苣根粗提物對反枝莧萌發(fā)指數(shù)的影響 表5反映了菊苣根粗提物對反枝莧萌發(fā)指數(shù)抑制率的影響。17.91%為菊苣根粗提物對反枝莧抑制作用顯著性的標記(表中以粗黑體表示)，抑制率在17.91%以上表明其抑制作用顯著(P<0.05)，菊苣根粗提物對反枝莧的促進作用較稗草強，但促進作用主要出現(xiàn)在較小質量濃度中。隨質量濃度減小，抑制作用減弱，40.5 g/L時16種處理的抑制率均高于對應組的其他質量濃度，抑制效果顯著(P<0.05)；其次13.5 g/L時各處理組的抑制率均高于其余3個低質量濃度，除T14和T15外，其他抑制作用均顯著(P<0.05)；質量濃度為4.5 g/L時，除T2、T3、T4、T8、T12和T16外，其余無抑制作用或有利發(fā)芽；0.5 g/L時僅T2、T8、T12和1.5 g/L時T4、T8、T12抑制顯著。T4、T8、T12和T16的質量濃度為13.5 g/L，T4、T8和T12的質量濃度為4.5 g/L時的抑制率依然與2,4-D有等效(P>0.05)結果。

表4 菊苣根粗提物對稗草萌發(fā)指數(shù)的抑制率及與2,4-D的比較

表5 菊苣根粗提物對反枝莧萌發(fā)指數(shù)的抑制率及與2,4-D的比較

3 討論與結論

超聲波輔助提取的文獻在近幾年研究較多，且多數(shù)研究了最佳提取條件的組合，如超聲波輔助提取淫羊藿(Epimediumbrevicornu)葉片中的朝霍定C[24]，超聲波輔助提取姜味草(Micromeriabiflora)中的熊果酸和齊墩果酸[25]等，本研究的目的之一也是利用超聲波輔助提取，考察多因素對菊苣根粗提物的影響，進而對各因素進行條件優(yōu)化?？樟械臉O差明顯小于其他因素的極差，充分顯示本試驗設計的正確和合理。水是一種極性大、無污染的常用溶劑[26]，用水做溶劑研究植物提取物活性的相關文獻有：蒼耳(Xanthiumsibiricum)水提取物對不同植物幼苗萌發(fā)的抑制作用[27]；水提取腫柄菊(Tithoniadiversifolia)鮮莖和鮮根中的活性物質研究其化感作用[28]；糙石芥(Moslascabra)水提取物已被證明有抵抗流感病毒的功效[29]等。乙醇是一種極性適中的重要溶劑，孫孌姿等[30]曾用3種溶劑包括無水乙醇提取菊苣根，發(fā)現(xiàn)無水乙醇對其試驗中的幾種草抑制最好。所以本研究結合水無污染、來源豐富、極性大和乙醇極性適中易溶于水等特點，將乙醇體積分數(shù)設為提取因素之一。菊苣根粗提物的提取結果顯示：T1、T5、T9和T13的提取率普遍高于其他(表2)，由正交表可看出該4個處理組均是乙醇體積分數(shù)為0，即水的提取條件最好。與某些文獻報道結果有異，例如Khan等[31]得出80%乙醇溶液對橘子皮中的多酚提取最佳，分析原因可能有三，一是水的極性大，二是研究材料菊苣根中含大量糖，糖恰易溶于水，三是本試驗研究的提取物是粗提物。其他條件優(yōu)化參數(shù)均有相關文獻報道，如超聲溫度65℃[32]，浸泡時間24 h[33]，浸泡2次[12]，超聲時間30 min[34]等。

近年來，植物活性物質的研究日益深入，應用廣泛，已不僅僅停留于藥用價值[35]，而已推廣到除草[20]、殺蟲[36]和殺菌[18]等。植物源農藥是人類歷史上最古老的生物農藥之一，化學農藥的發(fā)展在一定程度上有賴于植物源農藥，但是大量化學農藥的不合理使用，導致農產(chǎn)品的污染日益嚴重[37]，隨著對植物源農藥更進一步的認識，植物再度成為開發(fā)新的無污染天然農藥的寶貴資源[38]。植物的各個器官或組織中均含有多種化合物，其中某些化合物就是用于保護自己、抑制他物的，例如生物堿[39]，精油[18]等已被證實有除草功能，其中從草本植物中提取精油是植物資源開發(fā)利用價值之一[40]。根是植物的重要器官，也是研究提取活性物質的重要對象之一[41]。本研究結果顯示，16種不同處理下的菊苣根粗提物對稗草和反枝莧均有除草活性，且部分處理組與2,4-D (1 g/L) 有等效功能。2,4-D是一種常見且重要的除草劑，但研究發(fā)現(xiàn)2,4-D對魚類有毒性[42]，隨著對農藥使用的嚴格要求，菊苣根提取物作為植物源除草劑比2,4-D有優(yōu)勢。

綜上所述，本研究的試驗設計合理，提取結果可靠，證明了超聲波輔助提取是快速提取的有效工具之一。隨著對環(huán)境無污染友好型農藥研究的必然趨勢，以及根據(jù)研究得出的菊苣根粗提物有除草活性的結果可見，菊苣根提取物具有開發(fā)作為天然除草劑的潛力。

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