劉玉民，劉亞敏，徐娜婷，何丙輝

(西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院 西南大學(xué)三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實驗室，重慶 400715)

厚葉扇子花(譯名)(Scaevolacrassifolia)，英文名Thick-leaved fan flower，是草海桐科草海桐屬植物，澳大利亞特產(chǎn)。其特點(diǎn)是多年生、生長快、適應(yīng)性較強(qiáng)、易養(yǎng)護(hù)，種植當(dāng)年即開花，花量大、花期長、花形特別，是澳大利亞花卉市場的重要種類，并已在歐洲和北美引種成功，深受消費(fèi)者喜愛，作為地栽和盆栽花卉被廣泛栽植于廣場、庭院、陽臺等地，極具市場前景和經(jīng)濟(jì)價值。Scaevola屬植物因其花呈扇子形而被統(tǒng)稱為扇子花，2007年作為國家林業(yè)局“948”引進(jìn)項目被引種到我國進(jìn)行試驗栽培，厚葉扇子花為其中的1個種，但由于其種子發(fā)芽率極低，用種子繁殖比較困難，引種后一直未能在我國進(jìn)行大面積推廣。扦插繁殖方法能夠有效解決某些用種子繁殖困難的植物快速繁育問題，為了使澳大利亞特色花卉厚葉扇子花能在我國快速繁殖和推廣，豐富我國的花卉資源種類，本研究探討IBA處理對厚葉扇子花扦插生根的影響，分析扦插生根過程中過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)和吲哚乙酸氧化酶(IAAO)等關(guān)聯(lián)酶活性變化，旨在為確定正確的厚葉扇子花無性扦插快繁技術(shù)提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1扦插試驗 厚葉扇子花插穗來源于西南大學(xué)溫室大棚內(nèi)種子繁殖的植株(作為國家林業(yè)局“948”引進(jìn)項目，2007年西南大學(xué)等項目承擔(dān)單位從澳大利亞引進(jìn)的種子，種子發(fā)芽率僅為4%)。扦插試驗于2009年5月初在西南大學(xué)溫室大棚內(nèi)進(jìn)行，在厚葉扇子花母株上剪取粗約0.3 cm的側(cè)枝，摘去下部葉片，保留3～4片上部葉片和頂芽，剪成長度為8 cm的插穗，下切口平剪，扦插前用質(zhì)量濃度為250 mg/L的IBA溶液浸泡2 min，對照用蒸餾水浸泡2 min。扦插基質(zhì)為珍珠巖、紫色土、腐殖土的混合基質(zhì)(體積比為1∶1∶1)。插后保持溫室遮光率為60%左右，相對濕度控制在70%～80%，溫度控制在20～30℃，按照需要進(jìn)行噴霧處理，常規(guī)管理。扦插試驗采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，3次重復(fù)，每個區(qū)組將對照及用IBA處理的插穗各插200條，3個區(qū)組總計扦插1 200條。

1.2取樣及樣品處理 扦插后每隔4 d采樣一次，每個測定指標(biāo)均在3個區(qū)組各隨機(jī)取5株，采樣后洗凈吸干，先觀察其生根情況，然后取插穗基部3 cm皮部分別測定其POD、SOD、CAT、PPO和IAAO等酶的活性，進(jìn)行3次重復(fù)測定。

1.3測定方法 PPO活性采用李忠光和龔明[1]改進(jìn)的方法測定，取1.0 g插穗基部皮層放入研缽中，加入1 mL預(yù)冷的磷酸緩沖液(pH值7.8)研磨，再加1 mL緩沖液，傾入5 mL離心管，于4℃ 10 000 r/min條件下離心20 min，上清液即為酶液。反應(yīng)體系為3 mL 0.2 mol/L鄰苯二酚(用pH值7.8的磷酸緩沖液配制)，1 mL酶液，以滅活的酶液為空白對照，30℃下水浴10 min，立即用20%三氯乙酸中止反應(yīng)，5 000 r/min下離心10 min，于410 nm處測定其吸光值。POD活性采用愈創(chuàng)木酚法、SOD活性采用NBT光氧化還原法、CAT活性采用滴定法測定[2]，IAAO活性用比色方法測定[3]。

PPO以每克鮮樣品每分鐘A410光密度變化0.01個單位所需要的酶液量作為一個活力單位(U)，POD以每分鐘內(nèi)A470變化0.01為1個過氧化物酶活性單位(U)，SOD以抑制NBT光氧化還原50%的酶量為一個酶活性單位(U)，CAT以每克鮮樣品每分鐘內(nèi)分解1 mg過氧化氫為1個酶活力單位(U)；IAAO以每克鮮樣品在1 h內(nèi)分解破壞IAA的毫克數(shù)表示1個酶活性單位(U)。

1.4數(shù)據(jù)分析 用DPS統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，顯著性檢驗采用雙因素方差分析，多重比較采用最小顯著極差法(LSD)，利用EXCEL繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1厚葉扇子花扦插苗生根特性 觀察厚葉扇子花生根過程形態(tài)變化發(fā)現(xiàn)(表1)，無論是用IBA處理的插穗還是對照插穗下切口開始出現(xiàn)愈傷組織的時間均在扦插開始后8 d左右。部分插穗扦插后基部能形成愈傷組織，開始只出現(xiàn)一些半透明的、不規(guī)則的瘤狀突起物，后來有些形成環(huán)狀，這些插穗多數(shù)都能繼續(xù)生根；部分插穗基部不能形成愈傷組織并出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象，但仍能繼續(xù)長出不定根；少數(shù)插穗基部完全被團(tuán)狀的愈傷組織包圍，這類插穗生根數(shù)較少或不生根，但也不立即枯死，有些還能繼續(xù)抽稍、展葉；少數(shù)插穗基部發(fā)黑，這類插穗往往最終死亡，極少數(shù)基部發(fā)黑的插穗上端能長出不定根。經(jīng)IBA處理的插穗有45%能長出愈傷組織且能繼續(xù)生長膨大，而對照插穗只有20%能長出愈傷組織且多數(shù)不能繼續(xù)膨大。經(jīng)IBA處理的插穗扦插后，第12天開始形成不定根，第30天時生根率為89%，不定根條數(shù)范圍為2～46條，平均不定根條數(shù)為25條，生根植株最大根長為3.4 cm，平均根長為1.3 cm。對照插穗扦插后，第14天開始形成不定根，第30天時生根調(diào)查顯示生根率為62%，不定根條數(shù)范圍為1～30條，平均不定根條數(shù)為13條；生根植株最大根長為2.9 cm，平均根長為0.9 cm。多數(shù)厚葉扇子花扦插苗不定根是從插穗基部3 cm范圍內(nèi)的皮部長出，極少數(shù)從愈傷組織處長出，且生根優(yōu)良的插穗愈傷組織發(fā)育往往較弱，因此厚葉扇子花扦插苗應(yīng)為皮部生根類型。

表1 厚葉扇子花扦插苗生根特性

2.2厚葉扇子花扦插生根過程相關(guān)酶活性變化

2.2.1POD活性變化 POD是植物對膜脂過氧化酶促防御系統(tǒng)中重要的保護(hù)酶，主要起到酶促降解H2O2的作用[4]。POD的活性與離體植物生根有密切關(guān)系，是植物生根標(biāo)志性物質(zhì)之一[5]，其作用的某些產(chǎn)物是不定根發(fā)生和發(fā)展所必須的輔助因子，能促進(jìn)不定根的形成[6]。在不定根誘導(dǎo)期和表達(dá)期，POD活性升高是有生根能力的標(biāo)志[7-8]。厚葉扇子花扦插生根過程中POD活性成規(guī)律性變化(圖1)，經(jīng)IBA處理的插穗和對照插穗POD活性在扦插初期均升高，且均在10 d左右達(dá)到高峰，之后開始下降，處理插穗POD活性在扦插15 d后基本穩(wěn)定，對照插穗扦插20 d后基本穩(wěn)定。處理與對照插穗中POD活性差異顯著(P<0.05)，表明激素處理能提高插穗的POD活性，這種活躍的生理狀態(tài)對生根有利，在生根的不同階段POD活性有顯著變化(P<0.05)。

圖1 厚葉扇子花扦插過程種POD活性變化

圖2 厚葉扇子花扦插過程種SOD活性變化

2.2.3CAT活性變化 CAT酶在體內(nèi)的主要作用是清除H2O2，有效地保護(hù)細(xì)胞免受損傷[11]。厚葉扇子花扦插生根過程中CAT活性成規(guī)律性變化(圖3)，經(jīng)IBA處理的插穗和對照插穗基部CAT活性在扦插初期均降低，隨著不定根的凸出和生長又開始升高，最小值出現(xiàn)在扦插后10 d左右。經(jīng)IBA處理的插穗CAT活性比對照降低的更明顯，且在整個扦插生根過程中始終低于對照。經(jīng)IBA處理的插穗與對照插穗中CAT活性有顯著差異(P<0.05)，在生根的不同階段CAT活性有變化但差異不顯著(P>0.05)。

圖3 厚葉扇子花扦插過程種CAT活性變化

2.2.4PPO活性變化 PPO能催化酚類物質(zhì)和IAA形成一種“IAA-酚酸復(fù)合物”[12]，這種復(fù)合物具有促進(jìn)不定根形成的活性[13]，PPO還能催化生長素的代謝，促進(jìn)不定根的起源與發(fā)育[14]。厚葉扇子花扦插生根過程中PPO活性均表現(xiàn)為扦插初期上升，達(dá)到最大值后開始下降(圖4)。處理與對照插穗中PPO活性高峰期出現(xiàn)的時間不同，經(jīng)IBA處理的插穗在扦插后15 d左右達(dá)到高峰，而對照插穗在扦插后20 d左右達(dá)到高峰。處理與對照插穗中PPO活性差異不顯著(P>0.05)，在生根的不同階段PPO活性有顯著差異(P<0.05)。

圖4 厚葉扇子花扦插過程種PPO活性變化

2.2.5IAAO活性變化 IAA是一種植物生長素，能促進(jìn)不定根的發(fā)生與發(fā)育，而IAAO能降解IAA，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的IAA含量，影響植物的生長發(fā)育，因此IAAO活性的大小與根的發(fā)生有重要關(guān)系[15]。厚葉扇子花扦插生根過程中IAAO活性均表現(xiàn)為先降低后升高的趨勢(圖5)。經(jīng)IBA處理的插穗IAAO活性最小值出現(xiàn)在扦插后15 d左右，對照插穗出現(xiàn)在扦插后20 d左右。經(jīng)IBA處理的插穗IAAO活性比對照降低的更明顯，且在整個扦插生根過程中始終低于對照，處理與對照插穗之間IAAO活性差異顯著(P<0.05)，在生根的不同階段IAAO活性有顯著差異(P<0.05)。

圖5 厚葉扇子花扦插過程種IAAO活性變化

3 討論與結(jié)論

厚葉扇子花屬于皮部生根類型，用適宜濃度的IBA處理厚葉扇子花插穗能提高其生根率和根系質(zhì)量。過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、吲哚乙酸氧化酶、多酚氧化酶等活性酶均與厚葉扇子花生根過程有密切關(guān)系，直接影響植物的生根特性。IBA處理明顯改變了厚葉扇子花插穗內(nèi)過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、吲哚乙酸氧化酶、多酚氧化酶等氧化酶的活性，且在生根過程中成規(guī)律性變化，其中過氧化物酶、超氧化物歧化酶和多酚氧化酶活性在扦插后逐漸升高，在根系形成期達(dá)到高峰，然后又逐漸下降；過氧化氫酶和吲哚乙酸氧化酶活性表現(xiàn)為先降低后升高的趨勢，在根系形成期達(dá)到最小值。

植物體內(nèi)的過氧化物酶、吲哚乙酸氧化酶、多酚氧化酶等酶之間存在密切的關(guān)系，具有許多共同特征，有些過氧化物酶同工酶具有吲哚乙酸氧化酶活性，有些具有多酚氧化酶的活性[16]；而有些植物體內(nèi)吲哚乙酸氧化酶也具有過氧化物酶的性質(zhì)[17]。過氧化物酶、吲哚乙酸氧化酶、多酚氧化酶活性高低可作為判定植物生根難易的指標(biāo)之一，吲哚乙酸氧化酶是調(diào)節(jié)IAA含量的重要酶，而IAA的一個非常重要的生理功能就是促進(jìn)不定根的形成。因此，吲哚乙酸氧化酶通過氧化IAA來控制植物的生根狀況。相關(guān)研究認(rèn)為，一些植物離體生根的誘導(dǎo)期內(nèi)高活性的吲哚乙酸氧化酶使內(nèi)源IAA水平降低，低濃度的IAA有利于生根，在表達(dá)期吲哚乙酸氧化酶活性降低使得植株內(nèi)源IAA含量升高，高濃度的IAA能促進(jìn)根的生長[5,7,18-21]。本研究中，厚葉扇子花插穗體內(nèi)吲哚乙酸氧化酶的變化表現(xiàn)為根系誘導(dǎo)期較高、表達(dá)期較低、生長期又升高的趨勢，與相關(guān)研究結(jié)論一致；有研究認(rèn)為，過氧化物酶，也能氧化IAA，從而調(diào)節(jié)植物生根能力[22]，當(dāng)植物體內(nèi)的過氧化物酶、吲哚乙酸氧化酶活性較高時，降解IAA的作用強(qiáng)，IAA被破壞較多，對誘導(dǎo)生根不利。當(dāng)植物體內(nèi)的過氧化物酶、吲哚乙酸氧化酶活性較低時，降解IAA能力較弱，對誘導(dǎo)根原基的形成有利。而本研究中，過氧化物酶和吲哚乙酸氧化酶活性變化趨勢并不相同，這說明過氧化物酶和吲哚乙酸氧化酶對植物生根的聯(lián)合影響具有復(fù)雜性，可能因物種不同而異，有待于進(jìn)一步深入研究；植物體內(nèi)的酚類物質(zhì)對不定根的起源和發(fā)育起著極其重要的作用[20]，多酚氧化酶能催化酚類物質(zhì)與IAA縮合而形成一種“IAA-酚酸復(fù)合物”[12]，這種復(fù)合物是一種生根的輔助因子，具有促進(jìn)不定根形成的活性[13]。在不定根形成時，體內(nèi)的酚類物質(zhì)含量會下降，被認(rèn)為這是由于酚類物質(zhì)在多酚氧化酶的作用下轉(zhuǎn)變的結(jié)果。因此，多酚氧化酶是影響不定根形成的一個重要因素。而本研究中，不定根形成期多酚氧化酶含量達(dá)到高峰，與前人研究的結(jié)論一致。雖然過氧化物酶、吲哚乙酸氧化酶、多酚氧化酶等活性高低直接影響不定根的形成，但也不能僅憑植物的過氧化物酶、吲哚乙酸氧化酶、多酚氧化酶等活性高低就判定植物生根的難易，因為生根是插穗內(nèi)激素種類和相對比例、生根抑制劑的存在與否、插穗內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)含量等多種因素綜合作用的結(jié)果。

植物從扦插開始到生根完畢會受到很多逆境脅迫的影響，插穗內(nèi)會產(chǎn)生大量自由基和活性氧，對植物造成很大傷害，過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶是保護(hù)酶系統(tǒng)的重要組成成分，能夠在一定程度下清除體內(nèi)過剩的活性氧和自由基[23-24]，影響植物的生根質(zhì)量。有研究表明一些植物扦插生根過程中過氧化物酶活性會出現(xiàn)兩個高峰值[18-19,22,25]，而本研究中厚葉扇子花在整個生根過程中只出現(xiàn)了一個峰值，這與前人[18-19,22,25]對其他植物的研究結(jié)果不同，可能是由于厚葉扇子花屬于皮部生根類型，所需生根的時間較短引起的，但這種推測還有待進(jìn)一步深入研究。

IBA能促進(jìn)植物體內(nèi)過氧化物酶、多酚氧化酶、吲哚乙酸氧化酶等酶的活性變化，從而促進(jìn)細(xì)胞的脫分化，產(chǎn)生愈傷組織。本研究從生根過程中相關(guān)氧化酶變化方面揭示了厚葉扇子花生根的生理響應(yīng)機(jī)制，但由于影響植物扦插生根的因素較多，只有對插穗內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)含量、內(nèi)源激素水平等與生根相關(guān)指標(biāo)的變化規(guī)律進(jìn)行詳細(xì)研究后，才能更確切地闡明厚葉扇子花的生根機(jī)理。

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