張 磊,劉志鵬,張吉宇,張妙青,王彥榮

(蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,甘肅 蘭州 730020)

高等植物甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)可以分為兩個(gè)亞類，一類存在于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)，由同型的4個(gè)GapC亞基構(gòu)成，以NAD(H)為輔酶，是糖酵解過程中的關(guān)鍵酶之一；另一類存在于成熟葉綠體中，由GapA和GapB兩種亞基構(gòu)成，以NADP(H)或NAD(H)為輔酶，參與光合作用Calvin循環(huán)中的能量固定過程[1-3]。甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性與生物體能量代謝過程密切相關(guān)，它廣泛參與了植物以及真菌對(duì)低溫，高鹽，干旱，熱激以及病害等逆境脅迫的生理及病理響應(yīng)過程[4-8]；GAPDH基因在進(jìn)化上具有保守性，因此也常被用作判定植物親緣關(guān)系的依據(jù)[1]。

箭筈豌豆(Viciasativa)是豆科野豌豆屬植物，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和較強(qiáng)的抗寒特性[6]，是適宜在高寒高海拔地區(qū)栽培的優(yōu)良牧草。先前的研究表明，箭筈豌豆品系2505，2556和2560在我國(guó)青藏高原地區(qū)經(jīng)過多年馴化[7]，其后代已經(jīng)表現(xiàn)出穩(wěn)定的遺傳特性和良好的生產(chǎn)性能[8-9]，具有進(jìn)一步的育種潛力。引種后代與原種相比，包括抗逆特性在內(nèi)的多種指標(biāo)均發(fā)生了顯著變化[10]，同時(shí)過氧化物酶同工酶酶帶暗示了短期馴化過程中分子水平上的改變[9]。然而，目前對(duì)箭筈豌豆的分子生物學(xué)研究尚不深入，關(guān)于箭筈豌豆GAPDH基因，尤其是它在作物高寒適應(yīng)過程中的作用研究鮮見報(bào)道，這在很大程度上限制了基因工程在箭筈豌豆育種中的應(yīng)用。有鑒于此，本研究開展有關(guān)箭筈豌豆GAPDH基因的克隆研究，為箭筈豌豆未來的育種研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1植物材料 箭筈豌豆采用引進(jìn)品系2560，在蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院試驗(yàn)地盆栽，采集幼嫩莢果，液氮處理后于-80℃超低溫保存。

1.1.2試劑 RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)， PrimeScriptTMRT-PCR Kit(TaKaRa)，DNA凝膠回收試劑盒，pGM-T克隆試劑盒，DH5α感受態(tài)細(xì)胞，DNA Marker均購自天根生化科技(北京)有限公司。引物由北京賽百盛生物工程公司合成。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1引物設(shè)計(jì) 檢索NCBI上已公布的植物GAPDH基因序列信息，選取與箭筈豌豆親緣關(guān)系較近物種的GAPDH蛋白序列進(jìn)行比對(duì)找出高度同源區(qū)域，用Primer Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)[9]。確定一對(duì)引物：P1(正向引物)：5′TCTCACTCTTTCCCAACTCAAT 3′，P2(反向引物)：5′TGTCATACCAAGCAACCACC 3′，預(yù)測(cè)片段長(zhǎng)度為1 141 bp。

1.2.2RNA總量的提取 參照RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)使用說明提取箭筈豌豆幼嫩莢果總RNA，產(chǎn)物用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行純度測(cè)定，通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)RNA完整性[10]。

1.2.3RT-PCR擴(kuò)增 cDNA第一鏈合成參照PrimeScriptTMRT-PCR Kit(TaKaRa)使用說明，PCR反應(yīng)體系50 μL：10×PCR Buffer 5 μL；dNTP Mixture(10 mmol/L)2 μL；Ex Taq HS(5 U/μL)0.5 μL；引物P1和P2各1 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性1 min，然后以94℃ 30 s，58℃ 30 s ，72℃ 1 min進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，于72℃延伸10 min，取5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4陽性克隆的篩選與鑒定 PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收后克隆在pGM-T，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過藍(lán)白斑篩選挑取陽性克隆，經(jīng)過PCR鑒定后送上海生工進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5序列的生物信息學(xué)分析 序列翻譯，比對(duì)通過DNAMAN軟件進(jìn)行，在NCBI(http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)網(wǎng)站上進(jìn)行Blast檢索[11]，用MEGA 4.0構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1RNA總量的提取及檢測(cè) 提取幼嫩莢果總RNA后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示28S rRNA、18S rRNA 條帶清晰，且前者亮度約為后者的2倍(圖1)，表明所提取RNA完整性較好；經(jīng)NANODROP 1000紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，260/280、260/230分別為1.92、2.11，說明純度較高，所提取RNA可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 箭筈豌豆莢果總RNA 1%瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2RT-PCR 擴(kuò)增 以總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第一鏈作為模板，用引物P1和P2擴(kuò)增GAPDH基因片段，瓊脂糖凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)約在1 141 bp附近有一亮帶，且上下無雜帶，與目的產(chǎn)物大小相近(圖2)。推測(cè)此條帶可能是GAPDH基因片段，結(jié)果有待進(jìn)一步鑒定。

圖2 RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

2.3陽性克隆的鑒定 將目的片段切膠回收，連接至pGM-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過藍(lán)白斑篩選隨機(jī)挑取10個(gè)陽性克隆提取質(zhì)粒，選取3個(gè)樣本提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，目的產(chǎn)物大小約為1 141 bp，與RT-PCR結(jié)果一致(圖3)。將樣本送往上海生工測(cè)序。

圖3 陽性克隆的PCR鑒定

2.4測(cè)序結(jié)果及序列分析 測(cè)序結(jié)果顯示，插入片段長(zhǎng)度為1 141 bp、編碼381個(gè)氨基酸(圖4)。Blast比較結(jié)果顯示，該核酸片段與多種植物GAPDH的GapB亞基基因核酸序列相似度達(dá)83%，編碼氨基酸序列的相似度在95%以上，表明克隆獲得的片段為組成箭筈豌豆GAPDH的GapB亞基基因片段。

圖4 箭筈豌豆GAPDH基因片段的核苷酸序列及推測(cè)的氨基酸序列

將預(yù)測(cè)的箭筈豌豆GAPDH氨基酸序列與大豆(Glycinemax，ABA86963.1)，豌豆(Pisumsativum，ABA86964.1)，蓖麻(Ricinuscommunis，XP_002500706.1)，煙草(Nicotianatabacum，P09044)，擬南芥(Arabidopsisthaliana，NP_174996.1)，菠菜(Spinaciaoleracea，P12860.1),玉米(Zeamays，CAA10352.1)，日本稻(Oryzasativasupsp.Japonica，ABF93788.1)和印度稻(O.sativasupsp.Indica，AAB8213301)的GAPDH氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析(圖5)及多重比較(圖6)，發(fā)現(xiàn)它的保守位點(diǎn)為353個(gè)，而非保守位點(diǎn)為28個(gè)，說明本研究克隆到的片段為箭筈豌豆GAPDH基因的高度保守區(qū)域。進(jìn)一步的分析表明(圖6)，該片段與大豆GAPDH的相似度最高，達(dá)99%；與日本稻GAPDH的相似度最低，為93%；與擬南芥GAPDH相似度94%。故將克隆到的基因命名為VsGAPDH，并在GenBank注冊(cè)，登錄號(hào)HM117006。

圖5 VsGAPDH與其他植物GAPDH基因的氨基酸序列的進(jìn)化樹分析

3 討論

構(gòu)成高等植物GAPDH的三類亞基(GapA，GapB和GapC)并非起源于共同祖先，GapA與GapB具有較高的序列相似度，GapC與GapA或B的氨基酸序列相似度僅為45%，暗示GapA與GapB具有較近的親緣關(guān)系[12]。本研究克隆獲得的基因片段與多種植物GapB基因序列高度相似，其中與大豆GapB基因相似度為99%，與擬南芥GapB基因相似度94%，表明這一片段為來自箭筈豌豆的GapB基因。

高等植物GapB基因在進(jìn)化上較為保守，其氨基酸序列相似度在一定程度上反映不同物種親緣關(guān)系遠(yuǎn)近[13]。分析表明，箭筈豌豆GapB與豆科其他物種相關(guān)基因相似度較高。目前，對(duì)箭筈豌豆的遺傳背景所知有限，同源克隆仍是獲得功能基因的首選技術(shù)。因此，借鑒近緣物種如大豆，豌豆上的現(xiàn)有研究成果將極大提高箭筈豌豆的功能基因克隆及研究的效率。

在高海拔地區(qū)引種馴化的箭筈豌豆品系與原種相比表現(xiàn)出抗旱能力增強(qiáng)，生育期縮短，種子產(chǎn)量增加等多種可能與能量代謝相關(guān)的性狀[14]。同工酶表達(dá)差異在一定程度上與這些性狀在品種間的差異相一致[15]。然而，進(jìn)一步的育種工作需要對(duì)這些特性產(chǎn)生的分子機(jī)制進(jìn)行深入分析。高等植物GAPDH基因參與了高等植物的碳固定，Calvin循環(huán)等能量代謝過程[1]，因而箭筈豌豆GAPDH基因的克隆將為相關(guān)工作的開展奠定基礎(chǔ)。

圖6 VsGAPDH氨基酸序列片段與其他植物GAPDH基因的氨基酸序列多重比較

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