張露明，方 程，張學勇，王兆明，王赟文

(1.中國農業(yè)大學動物科學技術學院草業(yè)科學系，北京 100193； 2.遼寧大學生態(tài)環(huán)境研究所，遼寧 沈陽 110036；3.遼寧省岫巖滿族自治縣草原監(jiān)理站，遼寧 岫巖 114300)

結縷草(Zoysiajaponica)作為一種優(yōu)良的暖季型草坪草已經(jīng)廣泛應用于運動場草坪、高爾夫球道、休憩草坪、城市綠化及水土保持等領域[1-3]。結縷草喜溫暖濕潤氣候，葉片厚硬而近革質，耐高溫、有一定的耐蔭性、耐寒、耐旱，在嚴重干旱條件下變黃；但在緊接著澆水或下雨的條件下即可恢復，結縷草有深的根莖系統(tǒng), 可以吸收更深層土壤的水分[4-6]。據(jù)報道，結縷草對于病蟲害具有較高的抗性，盡管為一定數(shù)量的病原物所危害，但其受病原危害的報道較其他草坪草更少[7]。已報道結縷草的病害有銹病(Pucciniaspp.)、黃葉病(Fusariumacuminatum)、春季壞死斑病(Rhizoctoniaspp.)和圓斑病(Sclerotiniahomoeo-carpa)、葉斑病(Bipolarishawaiiensis)等[8-10]。當空氣濕度較大，有露水或頻繁降雨后，植株葉片表面覆有水膜時，結縷草草坪比較容易受到銹病的侵害，對草坪質量造成較大的影響。結縷草銹病主要由結縷草柄銹菌(Pucciniazoysiae)引起[11]。何秋等[12]在南京地區(qū)對結縷草屬(Zoysiaspp.)種質材料銹病發(fā)病規(guī)律的研究表明，結縷草全年有4個發(fā)病高峰，其中6月中旬、7月中旬和8月上旬分別有3個發(fā)病小高峰，而10月下旬達到發(fā)病大高峰，而且感銹病性狀在結縷草屬種間及種內不同植株材料之間存在顯著差異，使得結縷草屬抗銹病遺傳及抗病品種選育成為可能。

結縷草在我國北方城市如北京、沈陽等也有較大面積的種植利用，銹病也是生產(chǎn)中遇到的主要病害之一。然而，北方地區(qū)結縷草銹病的發(fā)病規(guī)律及種質材料抗銹病評價還鮮有研究報道。為此，本研究于2008-2009年在北京地區(qū)進行了對結縷草銹病病原物的鑒定，調查了結縷草銹病流行規(guī)律，并且通過田間發(fā)病和溫室接種2種方法，對收集的結縷草植株種質材料進行抗銹性評價和篩選，為進一步深入進行抗銹病分子標記和抗病品種選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗地點與材料 2008-2009年，在中國農業(yè)大學上莊試驗站進行了結縷草銹病發(fā)病調查及田間評價。該試驗站位于北京市海淀區(qū)上莊鎮(zhèn)辛力屯村東，115°50′ E，40°02′ N，海拔50 m，屬暖溫帶大陸性季風氣候，年平均氣溫為11.4 ℃，絕對最低溫為-21.7 ℃，絕對最高溫為41.6 ℃，年平均降水量628 mm，全年無霜期211 d。

試驗材料有162份，是從山東省膠州市、遼寧省岫巖縣、安徽省滁州市等地采集的營養(yǎng)體植株，各材料的編號和數(shù)量見表1。

表1 參試結縷草種質材料編號及來源

1.2試驗方法

1.2.1銹病病原菌鑒定 田間觀察并記錄發(fā)病植株及葉片癥狀，夏孢子及冬孢子堆的特點，使用顯微鏡鑒病葉上的夏孢子、冬孢子，用測微尺測量其大小，分別描述其形態(tài)特征對照《中國真菌志(第十卷)》[13]確定病原菌種類。

1.2.2病害流行規(guī)律及發(fā)病程度調查 2009年5月初開始，每隔3 d左右觀察田間初始發(fā)病時間，記錄夏孢子以及冬孢子出現(xiàn)時期。發(fā)病后每隔7 d調查一次，每株隨機選取100片葉片進行分級調查，計算病葉率和病情指數(shù)。分級標準參考結縷草銹病分級標準[9]，分為如下5級：Ⅰ級，葉片上無夏孢子堆(冬孢子堆)，代表值0；Ⅱ級，葉片上僅具有稀疏的夏孢子堆(冬孢子堆)，夏孢子堆(冬孢子堆)侵染葉片面積占總葉面積的10%以下，代表值1；Ⅲ級，葉片上夏孢子堆(冬孢子堆)密度中等，夏孢子堆(冬孢子堆)侵染葉片面積占總葉面積的10%～30%，代表值2；Ⅳ級，葉片上夏孢子堆(冬孢子堆)數(shù)較多，葉尖變黃枯死，夏孢子堆(冬孢子堆)侵染葉片面積占總葉面積的30%～60%，代表值3；Ⅴ級，葉片上夏孢子堆(冬孢子堆)密集、葉片大部分發(fā)黃、葉尖枯死，夏孢子堆(冬孢子堆)侵染葉片面積占總葉面積的60%以上，代表值4。

病情指數(shù)按單株計算，根據(jù)生長季各品種材料感染銹病的病情表現(xiàn)，獲得銹病發(fā)病動態(tài)圖。

在銹病發(fā)展高峰期，根據(jù)單株發(fā)病程度和普遍率對各參試材料的單株進行病情程度目測打分，分值為0～7分，0分表示未發(fā)病；1分，0～5%；2分，5%～10%；3分，10%～20%；4分，20%～40%，5分，40%～60%；6分60%～80%；7分，80%～100%。

1.2.3抗病性評價

(1)田間抗病性評價。參照《小麥條銹病測報標準》[14]，記載成株反應型、病葉率及病情指數(shù)，反應型分0(免疫)、0；(近免疫)、1、2、3、4六級。0(免疫)：葉片上不產(chǎn)生任何可見斑狀。0；(近免疫)：葉片上產(chǎn)生小型枯死斑，不產(chǎn)生夏孢子堆。1(高度抗病)：葉片上產(chǎn)生枯死條點或條斑，夏孢子堆很小，數(shù)目很少。2(中度抗病)：夏孢子堆小到中等大小、較少，其周圍葉組織枯死或顯著褪綠。3(中度感病)：夏孢子堆較大、較多，其周圍葉組織有褪綠現(xiàn)象。4(高度感病)：夏孢子堆大而多，周圍不褪綠。

(2)溫室接種評價。根據(jù)2008年初步觀察結果及田間調查發(fā)病程度數(shù)據(jù)選取材料SD-1單株10份，SD-2單株11份，SD-3單株10份，AH-1單株5份，LN-1單株7份，共計43份單株，用塑料花盆(直徑15 cm，高20 cm)培養(yǎng)健康植株，每盆栽種3個帶芽地下莖，重復2次。采集田間各材料上夏孢子，等量混合后備用。傍晚時分，在溫室內采用孢子懸浮液涂抹法，用無菌水將夏孢子堆配成懸浮液，于低倍鏡下觀察每視野50～60個夏孢子，每單株接種1盆，每盆接種10片葉片，另取一組不接種夏孢子為對照。套袋、噴霧保濕，24 h后，拿掉塑料袋，室內溫度控制在21～25 ℃。接種10～15 d后進行抗性鑒定，記載單株反應型。

2 結果與分析

2.1銹病癥狀及病原菌鑒定 結縷草成株銹病發(fā)病初期，葉片上病癥不明顯，隨后迅速出現(xiàn)黃色或鮮黃色夏孢子堆。夏孢子堆散生，點狀、長條形或橢圓形，長0.1～3.5 mm，凸起，被葉表皮覆蓋，成熟后表皮破裂而外露并散發(fā)出黃色粉末(圖1)。發(fā)病嚴重時，葉面布滿夏孢子堆，葉片黃化枯死。

冬孢子堆主要著生葉背面，少數(shù)生于葉面，黑褐色或棕褐色，散生，橢圓墊狀，長0.3～2.1 mm (圖1)。

夏孢子黃色或鮮黃色，橢圓形或倒卵形(13～24)μm×(11～19) μm，壁1～3 μm，個別孢子頂端壁加厚，但是與孢子大小無關(圖1)。

圖1 結縷草銹病孢子堆及單孢子形態(tài)

冬孢子棕色或栗褐色，雙胞，橢圓形，具長柄，表面光滑，兩端圓或基部稍縊縮，隔膜處稍縊縮或不縊縮(圖1)。冬孢子側壁1～4 μm，頂端增厚4～7 μm，冬孢子柄長度可達90 μm。

根據(jù)結縷草銹病田間癥狀、病原菌的基本生活規(guī)律并結合光學顯微鏡下病原菌的形態(tài)特征，對照《中國真菌志(第十卷)》[13]檢索表，確定病原菌為結縷草柄銹菌。

2.2田間銹病流行規(guī)律 據(jù)2009年觀測，自5月下旬開始，參試材料當中，個別結縷草植株葉片正面出現(xiàn)非常小的點狀橙黃色夏孢子堆，多數(shù)位于葉緣部位，孢子堆周圍無明顯病斑。經(jīng)過4～7 d，發(fā)病部位逐漸隆起，而后表皮破裂產(chǎn)生大量的成熟的黃色粉末狀夏孢子。大部分參試材料在6-7月底陸續(xù)發(fā)病。夏孢子通過風力傳播，不斷進行再侵染，導致田間銹病大規(guī)模流行。9月中旬開始，大部分材料葉片背面或從夏孢子堆中開始逐漸出現(xiàn)黑褐色冬孢子堆，部分材料未出現(xiàn)冬孢子堆。

2009年，參試的162份種質材料單株的田間銹病的發(fā)病率為100%，平均病葉率為16.9%，平均病情指數(shù)為4.65。從生長季銹病發(fā)病動態(tài)分析，北京地區(qū)結縷草銹病發(fā)病呈單峰型的發(fā)病特點(圖2)。在5-8月初發(fā)展緩慢。隨著8月份降雨增多，空氣濕度變大，成熟夏孢子不斷再侵染，病情發(fā)展迅速，至9月中旬開始病情進入高峰期，尤其是單株周圍匍匐莖上新長出葉片感病嚴重，部分嚴重感病的材料葉片上銹孢子堆甚至層層疊起，全株呈現(xiàn)枯黃色。全年病情指數(shù)高峰發(fā)生在9月中旬-10月上旬。10月下旬氣溫驟降，植株逐漸進入枯黃期，病情指數(shù)顯著降低，至11月下旬銹病病害基本停止發(fā)展。

銹病發(fā)病高峰時期在不同來源的種質之間存在一定差異(圖2)。LN-2材料病情指數(shù)在8月初發(fā)展迅速，8月底有一個發(fā)病小高峰，9月初稍有回落，而在9月底達最高峰，其平均病情指數(shù)為5.54，最高可達19.06。該參試材料采集自遼寧大學校園已種植10余年的結縷草草坪，表現(xiàn)出對銹病具有易感性。膠東青結縷草群體SD-1材料，銹病發(fā)病過程較為緩慢，在10月初達到高峰，高峰期持續(xù)1周。野生材料LN-1和AH-1病情指數(shù)分別為4.89和4.81，均高于平均水平。而人工選育材料SD-2及優(yōu)良野生材料SD-3病情指數(shù)較低，分別為4.15和4.05，且全年都只有一個病情高峰期。

圖2 2009年結縷草全年病情指數(shù)發(fā)展曲線

在2009年9月下旬，田間銹病發(fā)病高峰時期，通過田間目測打分的方法調查各材料單株發(fā)病程度，由圖3可見參試材料之間銹病發(fā)病程度存在明顯差異，而參試材料內單株之間發(fā)病程度也存在顯著差異(表2)?？傮w來看，評分為4～6分的占全部材料的72.2%，即大部分單株銹病發(fā)病程度在20%～60%，材料SD-1、SD-2和SD-3單株銹病發(fā)病情況評分包含各個分值范圍，尤其是SD-2和SD-3的發(fā)病變異系數(shù)達70.5%和77.0%，這些參試材料群體當中既有發(fā)病程度較高的單株，又有發(fā)病程度較低的單株，說明這2組材料中可能存在表現(xiàn)為抗病和感病的單株，群體中抗銹能力具有豐富的遺傳變異。其中SD-3中評分為1分的的材料有4份，占該群體單株總數(shù)的10.8%，表明SD-3中可能存在較為豐富的抗銹病種質。而材料AH-1、LN-1和LN-2內單株評分都是3分以上，發(fā)病程度均高于10%，AH-1和LN-1大部分單株為5～6分，而LN-2中多數(shù)單株更高，為6～7分，且群體發(fā)病程度變異系數(shù)相對較低，進一步說明這些材料受銹病危害程度普遍較為嚴重。

圖3 不同品系結縷草發(fā)病程度分布(目測)

2.3抗性鑒定 從田間抗性結果鑒定來看，供試162個材料，其中表現(xiàn)免疫或近免疫(0～0；)的有4個，占供試材料的2.5%，高抗品系9個，占材料總數(shù)5.6%，中抗品系17個，占材料總數(shù)10.5%，中感品系100個，占材料總數(shù)61.7%，高感品系33個，占材料總數(shù)20.4%，見表3。根據(jù)田間抗感類型，分別選擇材料SD-1、SD-2、SD-3、AH-1和LN-1中具有代表性健康植株移植到溫室進行室內鑒定，以進一步驗證田間抗性鑒定結果。

表2 不同品系結縷草發(fā)病程度比較分析

室內接種材料共43株，對照組未接種夏孢子材料均未出現(xiàn)感染銹病癥狀，而接種銹病夏孢子材料出現(xiàn)了不同感病程度。通過對發(fā)病材料銹病抗性鑒定表明，反應型與田間觀測結果基本一致的材料有29株，占67.4%。其余材料與田間觀測結果不一致，除1株溫室內接種評價結果較田間觀測病情指數(shù)低以外，其他13株材料溫室接種病原菌后，發(fā)病程度比田間觀測嚴重。溫室接種評價的43株材料當中，表現(xiàn)為免疫或近免疫的有2株，高抗病的5株，中抗的7株，表現(xiàn)為中感有13株，高感的16株。材料SD-2中編號為11-1、11-2的單株在田間及在溫室中接種后病部產(chǎn)生褪綠斑，不產(chǎn)生或極少產(chǎn)生夏孢子堆，表現(xiàn)出對銹病免疫或近免疫，而編號為2-8、14-1的單株在2種方法的抗性鑒定中均出現(xiàn)大量夏孢子堆，且葉片上不出現(xiàn)褪綠斑，將其鑒定為高感，由此可看出同一材料中，結縷草對銹病的抗性反應不同，具有較好的抗銹篩選基礎，可進一步深入抗性差異的遺傳研究。

3 討論與結論

通過對北京地區(qū)結縷草6個參試材料162個植株銹病發(fā)病規(guī)律、病原菌收集與鑒定，以及植株抗病性評價，確定結縷草葉銹病主要是由結縷草柄銹菌造成，與何秋等[12]在南京地區(qū)結縷草屬銹病病原菌的鑒定結果一致。結縷草柄銹菌為專性寄生菌，當溫度適宜且葉片表面覆有水膜時，病菌易于入侵結縷草葉片。調查發(fā)現(xiàn)結縷草銹病夏孢子堆主要呈條型或橢圓型，夏孢子堆周邊出現(xiàn)的長形水漬狀斑塊顯示夏孢子無法穿過葉脈。Martin和Pierre[15]通過電鏡分析認為造成該結果是由于結縷草柄銹菌菌絲無法進入結構組織、泡狀細胞或維管束周圍細胞壁加厚的細胞，病菌只在葉肉細胞間生長，通過吸器獲取營養(yǎng)物質。因此，真菌菌絲沿葉脈延伸形成了狹長的結構，而后葉片表皮破裂散發(fā)出粉末狀夏孢子，孢子堆長度由1～2 mm到3～4 mm不等。

表3 結縷草抗性鑒定比較(實際測定)

北京地區(qū)結縷草銹病夏孢子堆始發(fā)期集中在6月初-7月中旬，發(fā)病期較南京晚1個月左右，這可能與兩地的地理環(huán)境、各年份的氣候因素不同有關，同時不排除各年份流行的銹病生理小種有所不同。銹病直至7月下旬在個別單株上仍有發(fā)病，初次侵染時期延續(xù)的時間較長。另外劉建秀等[16]報道結縷草的抗病蟲性與種子產(chǎn)量呈極顯著負相關，即種子產(chǎn)量較高的種易受銹病侵染，這是由于結縷草種子成熟期較早，種子生產(chǎn)削弱草坪生命力，而使其在后期易受病蟲害侵襲。結合調查結果可見北京地區(qū)結縷草銹病初侵染防治關鍵時期在5月中下旬，此時可有針對性的對草坪進行病害管理。可施用藥劑如15%三唑酮可濕性粉劑200倍液，97%敵銹鈉原藥250～300倍液等，第1次施藥后，隔7～10 d再施1次，共2～3次[17]。同時注意適時合理灌溉，盡量減少葉片表面長時間濕度較高，以抑制病菌的萌發(fā)和侵染。隨著氣溫的上升和濕度增加，9月上旬病情迅速上升，因此在8月采取修剪或化學藥劑處理，可有效控制銹病病情發(fā)展。9月中旬結縷草葉片背面或夏孢子堆中開始逐漸出現(xiàn)黑褐色冬孢子堆，大部分材料冬孢子堆在9月下旬-10月中旬出現(xiàn)，冬孢子堆附著在植株殘體上越冬成為來年病害來源。陳林珍和陳禮琢[18]通過田間調查發(fā)現(xiàn)冬前修剪可推遲草坪銹病發(fā)病期，減輕病害發(fā)生的嚴重程度?？梢娙攵安萜盒藜羰菧p少春季病源的重要措施，在入冬前進行草坪修剪并清理病葉，會使翌年病源數(shù)量減少，有效降低銹病對結縷草草坪的危害程度。

培育優(yōu)良的具有抗銹病性狀的結縷草品種是銹病防治的根本方法。培育抗病品種的前提是獲得抗性種質材料。本研究收集了162個我國主要分布的結縷草種質材料，通過田間抗銹性鑒定篩選和室內接種銹菌抗性鑒定的對比檢驗，發(fā)現(xiàn)室內接種與田間鑒定結果基本一致，說明室內接種鑒定能基本反映出不同材料的抗性，這與何秋[19]對14份結縷草屬材料抗性鑒定研究得出的結論一致。由于接種溫濕度、光照、接種濃度、葉位、葉齡、接種部位及病原菌的保存時間等因素影響，室內接種與田間調查鑒定結果仍有一定出入，而銹菌是一種氣傳病害，氣候及環(huán)境因素對發(fā)病有較大影響。因此先進行室內接種，再結合田間鑒定能更為真實的反應結縷草抗病性。本研究通過2種方法的比對初步確定了3個具有抗銹遺傳多樣性的材料群體SD-1、SD-2和SD-3，并進一步篩選出14個表現(xiàn)為抗病的單株和29個表現(xiàn)為感病的單株。結縷草是一種異花授粉植物，品系間及品系內對銹病的抗性遺傳多樣性可能與其經(jīng)過多次雜交而具有較為復雜的遺傳背景有關?；诒狙芯拷Y果，可將抗病單株隨機雜交混合繁殖成一個具有綜合抗性的群體，在此基礎上進行輪回選擇，從而培育出具有優(yōu)良抗銹性的品種。同時可建立抗病及感病親本群體，通過進行遺傳學及分子生物學研究，進一步篩選和定位結縷草抗銹病基因，這將有利于深入研究結縷草抗銹病的遺傳機制和篩選出相關分子標記，并使其應用于抗病分子標記的輔助選擇育種中。

我國是全球結縷草分布最廣泛、儲蓄量最大的國家, 也是向國外出口結縷草種子的唯一國家, 在我國草坪業(yè)的發(fā)展過程中, 引種也起到了一定的作用。關于結縷草的資源開發(fā)利用與研究方面, 國內已做了大量工作, 這為今后的育種工作奠定了良好的基礎。分子標記技術(RAPD、RFLP和AFLP)也已在結縷草種質資源研究上得到應用，尤其是近年來SSR、EST-SSR、SRAP[20-21]等分子標記在結縷草上的開發(fā)和應用越來越廣泛深入，除了傳統(tǒng)育種技術外，新型的分子標記輔助選擇育種技術將加快國內結縷草新品種的選育。

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