王玉佳，畢玉芬，姜 華，邵辰光

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

隨著全球氣候的變暖和水資源短缺，植物的抗干熱能力已成為農(nóng)業(yè)研究中的重要問題。紫花苜蓿(Medicagosativa)是世界廣泛栽培的豆科牧草，在促進(jìn)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)治理方面發(fā)揮著重要作用[1]。以往有關(guān)紫花苜?？鼓嫘缘难芯看蠖嗉性诳购?、抗寒、抗高溫、抗病蟲害、耐鹽堿、耐酸鋁性等方面，這些研究主要集中在單一逆境因子。目前干旱和高溫常常協(xié)同發(fā)生在自然環(huán)境中[2]，為了降低這種環(huán)境對(duì)農(nóng)業(yè)帶來的損失，許多學(xué)者更注重這方面的研究。有研究表明[3-5]，干旱和高溫協(xié)同發(fā)生比干旱或高溫對(duì)植物生長(zhǎng)和產(chǎn)量構(gòu)成的危害要大。有研究表明，干旱高溫脅迫影響植物的生理生化特性，主要是在玉米(Zeamays)[6]，水稻(Oryzasativa)[7]、高羊茅(Festucaelata)和黑麥草(Loliumperenne)[8]、小麥(Triticumaestivum)[9]等植物，而對(duì)于紫花苜蓿干熱脅迫的研究鮮見報(bào)道。本研究選取6份紫花苜蓿種質(zhì)為研究對(duì)象，旨在為篩選適應(yīng)干熱地區(qū)的紫花苜蓿種質(zhì)改良工作提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1材料 供試紫花苜蓿種質(zhì)有6份，分別是：02，14，15，16，26和28號(hào)。02號(hào)種質(zhì)取自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)試驗(yàn)基地，其余材料取自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝溫室(這些材料是2009年5月12日從建水縣郊區(qū)種鵝廠試驗(yàn)地移栽到溫室)。

1.2試驗(yàn)方法 試驗(yàn)采用盆栽方式，將取自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)實(shí)習(xí)基地的土壤與腐殖質(zhì)和蛭石以10∶2∶1混勻裝在直徑40 cm、高30 cm的塑料盆中，灌水后將土壓實(shí)。2010年4月17日把供試苜蓿枝條扦插在盆中，待新生枝株高為10 cm左右時(shí)，拔出弱株，每盆保留10個(gè)健壯的植株，在溫室中進(jìn)行培養(yǎng)。2010年7月4日進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)供試種質(zhì)栽植6盆，其中3盆為對(duì)照，另3盆為干熱脅迫處理。3盆對(duì)照材料置于室外(自然條件)，每隔2 d澆水一次，空氣濕度40%左右；干熱脅迫的3盆材料在放入人工氣候箱前澆水(花盆底部有水流出)，14 h之后放入人工氣候箱(PQX型)。人工氣候箱光強(qiáng)為12 000 lx，空氣濕度為30%，白天(12 h)溫度為32 ℃，夜間(12 h)溫度為25 ℃。分別在脅迫處理后的第4天、第8天、第12天取葉片進(jìn)行生理指標(biāo)的測(cè)定，并測(cè)定土壤含水量。之后對(duì)各處理進(jìn)行復(fù)水(以花盆底部有水流出為準(zhǔn))，把復(fù)水后的各處理放入人工氣候箱，于第4天進(jìn)行生理指標(biāo)和土壤含水量的測(cè)定。對(duì)照各指標(biāo)的測(cè)定時(shí)間與各處理時(shí)間相同。

1.3測(cè)定內(nèi)容 土壤含水量采用烘干稱量法測(cè)定，葉綠素含量采用比色法，相對(duì)電導(dǎo)率采用電導(dǎo)儀法，水分飽和虧缺(WSD)采用烘干稱量法[10]。

1.4數(shù)據(jù)分析 用SPSS 17.0對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，繪圖采用Excel 2003軟件。

2 結(jié)果

2.1干熱脅迫下紫花苜蓿根際土壤相對(duì)含水量的變化 紫花苜蓿根際土壤相對(duì)含水量在脅迫處理后的第12天達(dá)到9.38%，比脅迫第4天下降了64.82%，比脅迫第8天降低了48.57%(表1)。與對(duì)照相比，脅迫第4和8天的處理其土壤相對(duì)含水量都達(dá)到顯著水平(P<0.05)，脅迫第12天時(shí)各處理土壤相對(duì)含水量達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。以上結(jié)果表明，隨著干熱脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，紫花苜蓿根際土壤相對(duì)含水量呈下降的趨勢(shì)，脅迫時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)土壤含水量的影響越嚴(yán)重。復(fù)水后，土壤相對(duì)含水量顯著增加，但低于處理前的土壤相對(duì)含水量。這時(shí)的土壤相對(duì)含水量已經(jīng)達(dá)到土壤田間持水量的40%～45%，達(dá)到重度水分脅迫水平。復(fù)水后各處理的土壤相對(duì)含水量與對(duì)照土壤相對(duì)含水量的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，表明在脅迫條件下，紫花苜蓿植物體內(nèi)水分虧缺嚴(yán)重，對(duì)土壤水分的消耗量增加，導(dǎo)致土壤含水量降低。

表1 對(duì)照及脅迫土壤相對(duì)含水量的變化 %

2.2干熱脅迫下紫花苜蓿葉片水分飽和虧缺的變化 在脅迫第4天，26號(hào)種質(zhì)葉片WSD顯著高于其他種質(zhì)(P<0.05)，高出幅度為29.91%～53.27%；在脅迫第8天，26號(hào)種質(zhì)葉片WSD顯著高于除15號(hào)外的其他種質(zhì)，高出幅度6.10%～57.13%；在脅迫第12天，14號(hào)種質(zhì)葉片WSD顯著高于其他種質(zhì)，高出幅度為6.10%～91.96%；在復(fù)水第4天，14號(hào)種質(zhì)葉片WSD顯著高于其他種質(zhì)，高出幅度為17.47%～48.11%(表2)。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，不同種質(zhì)葉片WSD均表現(xiàn)為：第12天>第8天>第4天，在脅迫的第4～8天，葉片WSD上升幅度在7.80%～43.65%，在脅迫的第8～12天，葉片WSD上升幅度在6.40%～98.70%；各種質(zhì)與各自對(duì)照相比，在第4天，只有26號(hào)種質(zhì)葉片WSD達(dá)到顯著水平，在第8、12天各種質(zhì)葉片WSD均達(dá)到顯著水平；復(fù)水后，各種質(zhì)葉片WSD均顯著下降，但均未達(dá)到對(duì)照水平。

2.3干熱脅迫下紫花苜蓿葉片相對(duì)電導(dǎo)率的變化 在脅迫第4天，15號(hào)種質(zhì)相對(duì)電導(dǎo)率顯著高于其他種質(zhì)(P<0.05)，高出幅度為5.05%～50.12%；在脅迫第8天，02號(hào)種質(zhì)相對(duì)電導(dǎo)率顯著高于其他種質(zhì)，高出幅度為5.89%～26.94%；在脅迫第12天，16號(hào)種質(zhì)相對(duì)電導(dǎo)率顯著高于其他種質(zhì)，高出幅度為2.07%～57.59%；在復(fù)水第4天，02號(hào)種質(zhì)相對(duì)電導(dǎo)率顯著高于除15號(hào)種質(zhì)外的其他種質(zhì)，高出幅度為3.64%～10.96%(表3)。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片相對(duì)電導(dǎo)率除16、15號(hào)種質(zhì)在第8天較第4天下降，14號(hào)種質(zhì)第12天較第8天下降，其他種質(zhì)表現(xiàn)為第12天>第8天>第4天，在脅迫的第4～8天，相對(duì)電導(dǎo)率上升幅度為2.95%～52.44%，在脅迫的第8～12天，相對(duì)電導(dǎo)率上升幅度為8.53%～46.62%；各種質(zhì)與各自對(duì)照相比，除14號(hào)種質(zhì)外，其他種質(zhì)在第12天都達(dá)到顯著水平；復(fù)水后，除14號(hào)種質(zhì)升高外，其他紫花苜蓿種質(zhì)相對(duì)電導(dǎo)率都降低，但均未達(dá)到對(duì)照水平。

2.4干熱脅迫下紫花苜蓿葉片葉綠素含量的變化 在脅迫第4、8天，16號(hào)種質(zhì)葉綠素含量顯著高于其他種質(zhì)(P<0.05)，高出幅度分別為10.15%～78.03%、25.01%～88.04%；在脅迫第12天，16號(hào)種質(zhì)葉綠素含量顯著高于除15和02號(hào)種質(zhì)外的其他種質(zhì)，高出幅度為9.09%～54.30%；在復(fù)水第4天，26號(hào)種質(zhì)葉綠素含量顯著高于其他種質(zhì)，高出幅度為32.76%～59.85%(表4)。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，除15號(hào)種質(zhì)外，其他種質(zhì)葉綠素含量表現(xiàn)為第4天>第8天>第12天，在脅迫的第4～8天，葉綠素含量下降幅度在3.00%～24.73%，在脅迫的第8～12天，葉綠素含量下降幅度在2.63%～19.92%；各種質(zhì)與各自對(duì)照相比，在第12天葉綠素含量都達(dá)到顯著水平；在復(fù)水后4天，除16和28號(hào)種質(zhì)外，其他紫花苜蓿種質(zhì)葉片葉綠素含量都有所上升，除26號(hào)種質(zhì)外，其他種質(zhì)均未達(dá)到對(duì)照水平。

表2 干熱脅迫、復(fù)水和正常生長(zhǎng)條件下不同紫花苜蓿葉片水分飽和虧缺的變化 %

表3 干熱脅迫、復(fù)水和正常生長(zhǎng)條件下不同紫花苜蓿葉片相對(duì)電導(dǎo)率的變化 %

表4 干熱脅迫、復(fù)水和正常生長(zhǎng)條件下不同紫花苜蓿葉片葉綠素含量的變化 mg/g

2.5干熱脅迫下紫花苜蓿葉綠素含量、葉片WSD和相對(duì)電導(dǎo)率的相關(guān)性分析 干熱脅迫下各紫花苜蓿種質(zhì)的葉綠素含量與葉片WSD呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.359，P<0.05)，與相對(duì)電導(dǎo)率呈負(fù)相關(guān)(r=-0.052)，表明在干熱脅迫下，葉綠素含量越高，葉片WSD和相對(duì)電導(dǎo)率越小；而相對(duì)電導(dǎo)率與葉片WSD呈正相關(guān)(r=0.328)，相關(guān)性未達(dá)到顯著水平，表明在干熱脅迫下，相對(duì)電導(dǎo)率越大，葉片WSD越大，反之亦然(表5)。

表5 干熱脅迫下紫花苜蓿葉綠素含量、WSD和相對(duì)電導(dǎo)率的相關(guān)性分析

3 討論

葉片水分飽和虧缺是衡量葉片水分狀況的一個(gè)重要指標(biāo)[10]。本結(jié)果表明，在干熱脅迫中，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，紫花苜蓿葉片水分飽和虧缺呈逐漸上升的趨勢(shì)，這與沈艷和謝應(yīng)忠[11]、Jiang和Huang[5]在研究植物抗性方面的結(jié)論一致。在正常條件下，相同生長(zhǎng)階段，不同紫花苜蓿種質(zhì)葉片水分飽和虧缺不同，這與植物本身的抗性有著密切關(guān)系；在干熱脅迫第4天，14號(hào)種質(zhì)的葉片水分飽和虧缺比對(duì)照低，這可能是脅迫條件還沒達(dá)到對(duì)植株水分代謝產(chǎn)生影響的水平，或者是脅迫條件下植物產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng)，使氣孔導(dǎo)度降低，進(jìn)而影響蒸騰速率[12]。

細(xì)胞膜相對(duì)透性的變化可以作為植物受傷害程度的指標(biāo)之一。本研究表明，在干熱脅迫下，紫花苜蓿葉片相對(duì)電導(dǎo)率大部分呈上升趨勢(shì)，脅迫處理的紫花苜蓿葉片相對(duì)電導(dǎo)率都比對(duì)照的大，這與姜義寶等[13]對(duì)植物耐熱性研究的結(jié)論一致。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著干熱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，葉綠素含量基本呈下降趨勢(shì)，這與沈艷和謝應(yīng)忠[11]的研究結(jié)果一致。趙鳳云和宋忠俊[7]研究了干旱高溫脅迫下轉(zhuǎn)基因水稻的生理變化，結(jié)果表明在復(fù)合脅迫下葉綠素含量下降更大。一般認(rèn)為抗旱性強(qiáng)的種質(zhì)比抗旱性弱的種質(zhì)相比，其葉綠素下降幅度較小，本研究表明，在干熱脅迫初期，28和16號(hào)種質(zhì)葉綠素含量下降幅度相對(duì)較小；在脅迫后期(脅迫12 d)16號(hào)種質(zhì)下降幅度較大，而14和02號(hào)種質(zhì)下降相對(duì)較小。本研究中，只有15號(hào)種質(zhì)葉綠素含量在脅迫第4～8天呈上升趨勢(shì)，其原因還有待于進(jìn)一步研究。

本研究表明，紫花苜蓿根際土壤相對(duì)含水量在脅迫處理后的第12天達(dá)9.38%，比脅迫第4天下降了64.82%，比脅迫第8天降低了48.57%。在干熱脅迫的第12天，紫花苜蓿葉片水分飽和虧缺、電導(dǎo)率達(dá)到最大、葉綠素含量降到最低，說明脅迫12 d已經(jīng)嚴(yán)重影響了紫花苜蓿的生長(zhǎng)，但是在復(fù)水后，6個(gè)紫花苜蓿種質(zhì)都恢復(fù)生長(zhǎng)，說明脅迫12 d不是6個(gè)紫花苜蓿種質(zhì)的致死水平，紫花苜蓿種質(zhì)對(duì)干熱脅迫的臨界水平，還有待于進(jìn)一步的研究。

本研究相關(guān)性分析表明，紫花苜蓿葉綠素含量與葉片水分飽和虧缺呈極顯著負(fù)相關(guān)，說明葉綠素含量越高，其葉片水分飽和虧缺越小，這一結(jié)論與沈艷和謝應(yīng)忠[11]的一致。本研究結(jié)果支持了Kupper等[14]的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)，即紫花苜蓿的葉綠素含量與其保水能力有極大關(guān)系。不同苜蓿抗旱性和耐熱性不同，有的種質(zhì)抗旱但不耐熱，有的耐熱但不抗旱，有的則既抗旱又耐熱，但是目前的研究大多都只集中在其中的一種抗性研究上，對(duì)于復(fù)合脅迫的研究還相對(duì)較少。本研究以干旱和高溫兩種因子互作，分析了紫花苜蓿對(duì)干熱脅迫的生理響應(yīng)，表明干熱脅迫對(duì)紫花苜蓿的生長(zhǎng)有嚴(yán)重的影響，克服了以往在抗性方面單一因子研究的局限性，豐富了抗性方面的研究?jī)?nèi)容，為今后更進(jìn)一步的研究提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

1)在干熱脅迫下，同一脅迫時(shí)間不同紫花苜蓿種質(zhì)葉片水分飽和虧缺、相對(duì)電導(dǎo)率、葉綠素含量差異性不同。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，6個(gè)紫花苜蓿種質(zhì)葉片水分飽和虧缺和相對(duì)電導(dǎo)率基本呈上升趨勢(shì)，葉綠素含量基本呈下降趨勢(shì)。與對(duì)照相比，在達(dá)到了重度脅迫水平時(shí)，26和14號(hào)種質(zhì)的葉片水分飽和虧缺最大；26號(hào)種質(zhì)的相對(duì)電導(dǎo)率較大，葉綠素含量相對(duì)較低，綜合這3個(gè)指標(biāo)初步得出26號(hào)種質(zhì)的耐干熱性較差，而28號(hào)種質(zhì)葉片水分飽和虧缺、葉綠素含量、相對(duì)電導(dǎo)率與對(duì)照相比變化幅度不是很大，初步得出28號(hào)種質(zhì)耐干熱性較好。

2)在處理水平上，與干熱脅迫第4、8天相比，在干熱脅迫處理的第12天，紫花苜蓿葉片水分飽和虧缺、相對(duì)電導(dǎo)率達(dá)到最大，葉綠素含量達(dá)到最?。辉趶?fù)水后，6個(gè)紫花苜蓿種質(zhì)都有不同程度的恢復(fù)，說明脅迫12 d不是脅迫的臨界水平。

3)通過相關(guān)性分析得出：在干熱脅迫下，葉綠素含量越高，葉片水分飽和虧缺和相對(duì)電導(dǎo)率越??；相對(duì)電導(dǎo)率越大，葉片水分飽和虧缺越大。說明葉片水分虧缺會(huì)嚴(yán)重影響紫花苜蓿葉綠素的含量，對(duì)細(xì)胞膜造成傷害。

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