徐忠寶，劉愛萍，吳晉華，黃海廣，徐林波，高書晶，喬艷榮

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.巴彥淖爾市封育飛播管理站，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000)

球孢白僵菌(Beauveriabassiana)是一種廣譜性的昆蟲病原真菌,在防治農(nóng)林害蟲上具有較好的應(yīng)用潛力[1]。球孢白僵菌對農(nóng)作物和牧草的遷飛性害蟲草地螟(Loxostegesticticalis)有一定的寄生作用。曹藝瀟和劉愛萍[2]研究表明，在溫度為26 ℃，相對濕度為95%的條件下，孢子濃度為1×109個/mL的球孢白僵菌對草地螟的致死速率最快，死亡率最高。人們一直在研發(fā)用于防治草地螟的球孢白僵菌制劑，可是生產(chǎn)的白僵菌制劑由于菌種退化以及營養(yǎng)條件不當(dāng)?shù)仍?，目前品質(zhì)不高，孢子含量太低，從而在一定程度上影響著白僵菌劑的推廣和使用效果[3]。除了經(jīng)常進(jìn)行蟲體復(fù)壯、選用優(yōu)良菌株外，還可以通過改善白僵菌的營養(yǎng)狀況來促進(jìn)孢子大量產(chǎn)生。人們在篩選菌株的同時，還開展其制劑與化學(xué)殺蟲劑混配的研究，以期提高白僵菌制劑的防治效果[4-5]。營養(yǎng)條件是影響白僵菌菌株生長的重要因素之一，李農(nóng)昌等[6]指出，不同的營養(yǎng)因素影響著白僵菌的生長及產(chǎn)孢水平，適宜的營養(yǎng)會促進(jìn)菌株生長，增強(qiáng)殺蟲活性。營養(yǎng)貧乏或缺失會導(dǎo)致菌株性狀的退化，造成菌落局變等現(xiàn)象，進(jìn)而影響真菌的活力[7-9]。碳源、氮源、微量元素等營養(yǎng)是白僵菌生長不可缺少的物質(zhì)和能量來源，只有在一定的營養(yǎng)供應(yīng)條件下才能夠生長和繁殖，只有對其最適的營養(yǎng)生長條件充分了解和認(rèn)識以后，才能進(jìn)行有效的大量生產(chǎn)，為完成生物農(nóng)藥的產(chǎn)業(yè)化提供重要依據(jù)和指導(dǎo)[10]。

自2007年起，在內(nèi)蒙古自治區(qū)主要牧草生產(chǎn)地采集球孢白僵菌，經(jīng)過室內(nèi)毒力測定篩選出效果較好的3株菌株。為將其盡快發(fā)展為可大量生產(chǎn)的生物農(nóng)藥，本研究分析碳源、氮源以及微量元素對草地螟球孢白僵菌生長和產(chǎn)飽量的影響，旨在篩選出生產(chǎn)高品質(zhì)球孢白僵菌孢子粉的營養(yǎng)需求。

1 材料與方法

1.1供試材料及培養(yǎng)基

1.1.1供試材料 編號Bb-D01的球孢白僵菌菌株采自興安盟(代欽塔拉蘇木)；編號Bb-S05的球孢白僵菌菌株采自鄂爾多斯市(準(zhǔn)格爾旗)；編號Bb-Y03的球孢白僵菌菌株采自烏蘭察布市(四子王旗)。

1.1.2基礎(chǔ)培養(yǎng)基 KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO40.5 g，Na2HPO40.65 g，H2O 1 000 mL，瓊脂20 g。

1.1.3供試培養(yǎng)基

供試碳源共4種(表1)，分別來自有機(jī)碳和無機(jī)碳。不同碳源在1 000 mL的培養(yǎng)基中的添加量根據(jù)各自的全碳含量相對于20 g蔗糖的全碳量折合而成。分別加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。

供試氮源共4種(表1),分別來自有機(jī)氮和無機(jī)氮。不同氮源在1 000 mL的培養(yǎng)基中添加量根據(jù)各自的全氮含量相對于10 g蛋白胨的全氮量折合而成。分別加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。

供試氮碳比培養(yǎng)基：選取葡萄糖和酵母浸粉為供試碳源和氮源(依試驗(yàn)結(jié)果選取)，進(jìn)行不同碳氮比對其生長指標(biāo)影響的測定。每個因素設(shè)4個水平(表2)。

微量元素培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上以添加微量元素(Cu2+、Fe3+、Zn2+、Mn2)單元素及多元素組合(從4個微量元素中，任取m(2≤m≤4)個元素，按照一定的順序排成一列，每一列作為一個多元素組合)，各單元素按0.001%添加，多元素組合中每種元素也按0.001%添加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基。以基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對照。

表1 不同碳源全碳含量和氮源全氮含量

表2 不同碳氮比組合

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1接種與培養(yǎng) 在無菌操作臺中取上述各培養(yǎng)基15～18 mL倒入培養(yǎng)皿(直徑9 cm)中，用直徑為4 mm的打孔器在培養(yǎng)3 d、生長一致的待測菌菌落邊緣打孔，接種于不同的碳源(葡萄糖、蔗糖、碳酸鈉和可溶性淀粉)和氮源(蛋白胨、硝酸鉀、牛肉膏和酵母浸粉)的培養(yǎng)基中。每處理重復(fù)3次，以無糖無氮培養(yǎng)基作為對照，置于(25±1) ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d。

1.2.2孢子懸浮液的配制 將各菌株接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，置于(25±1) ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待形成分生孢子后收集于裝有無菌水(含0.05%吐溫-80)的三角瓶中。經(jīng)磁力攪拌器攪拌30 min，直到孢子完全被打散再經(jīng)3層無菌紗布過濾，獲得純孢子懸浮液。再用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)配制成試驗(yàn)所需濃度的孢子懸浮液。

1.2.3菌落生長的測量 取孢子濃度1×108個/mL的各菌株孢子懸浮液100 μL，接種于固體培養(yǎng)基的中央，用滅菌玻璃涂棒涂布均勻，放于(25±1) ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d,采用十字交叉法用游標(biāo)卡尺每隔2 d測量菌落生長直徑，記錄并計(jì)算其生長率[10]。

1.2.4產(chǎn)孢量的測定 用直徑為5 mm的打孔器在菌落(孢子已成熟)的同一位置均勻打孔取菌，放入裝有玻璃珠的20 mL無菌水(含0.05%吐溫-80)三角瓶中混合均勻,再振蕩(200 r/min)20 min,使用血球計(jì)數(shù)板于光學(xué)顯微鏡(40×)下計(jì)數(shù),分別計(jì)算其產(chǎn)孢量,每處理5次重復(fù)。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[11]及Excel 2003軟件進(jìn)行處理、分析。方差分析均采用鄧肯新復(fù)極差法。

2 結(jié)果

2.1不同碳源對各菌株生長指標(biāo)的測定 有機(jī)碳源均能給Bb-D01、Bb-S05、Bb-Y03菌株提供碳源，但生長情況不同(表3)；葡萄糖作為碳源時，萌發(fā)率和產(chǎn)孢量最高，萌發(fā)率分別可達(dá)(79.50±3.00)%、(81.10±2.20)%和(90.22±1.20)%(表3)，產(chǎn)孢量分別可達(dá)(0.60±0.18)×108、(0.61±0.32)×108和(0.90±0.10)×108個/mL(表3)，蔗糖次之。各項(xiàng)生長指標(biāo)以葡萄糖作為碳源時最好，蔗糖次之。

無機(jī)碳源碳酸鈉作為碳源時，僅能為Bb-S05菌株提供碳源，且各項(xiàng)指標(biāo)均表現(xiàn)為無機(jī)碳源顯著低于有機(jī)碳源(P<0.05)(表3)。有機(jī)碳作為碳源時，最低萌發(fā)率為(39.50±2.10)%，無機(jī)碳源的最高萌發(fā)率僅為(0.10±0.10)%，兩者相差390多倍。無機(jī)碳源碳酸鈉作為碳源時Bb-D01與Bb-Y03菌株均未能萌發(fā)。

3個菌株菌落均為乳黃色或乳白色，絨毛狀傘形，菌落較厚；Bb-D01 和Bb-Y03菌株放射溝明顯，皺褶強(qiáng)烈，Bb-S05菌株無褶皺，有液滴出現(xiàn)。

以上結(jié)果表明，試驗(yàn)所選的有機(jī)碳源比無機(jī)碳源更適合內(nèi)蒙古自治區(qū)草地螟球孢白僵菌的生長，且以葡萄糖為最佳碳源，蔗糖次之，而無機(jī)碳源碳酸鈉則不適合作為本研究菌株的碳源。形態(tài)方面，有機(jī)碳源葡萄糖的菌株菌落顏色較深，且菌落厚于其他碳源；生長指標(biāo)方面，萌發(fā)率高、菌絲生長快、產(chǎn)孢量高，各生長指標(biāo)明顯高于其他碳源。

表3 不同碳源對3株菌株的萌發(fā)率、生長速率、產(chǎn)孢量的影響

表4 不同氮源對3株菌株的萌發(fā)率、生長速率、產(chǎn)孢量的影響

2.2不同氮源對各菌株生長指標(biāo)的測定 有機(jī)氮源和無機(jī)氮源均可作為Bb-D01菌株生長所需的能源物質(zhì)，維持菌株的正常生長(表4)。蛋白胨作為氮源時，菌絲生長最快，達(dá)到(3.00±0.20) mm/d，且與其他氮源差異顯著(P<0.05)。酵母浸粉作為氮源時，萌發(fā)率和產(chǎn)孢量最優(yōu)，分別為(96.30±0.50)%、(1.15±0.11)×108個/mL。無機(jī)氮源的各項(xiàng)指標(biāo)均顯著低于有機(jī)氮源的(P<0.05)。

Bb-S05菌株對有機(jī)氮源和無機(jī)氮源均能利用，且菌絲生長正常。蛋白胨和牛肉膏之間各項(xiàng)生長指標(biāo)無顯著差異(P>0.05)。以酵母浸粉為氮源時，與其他氮源相比促進(jìn)作用最強(qiáng)，各項(xiàng)指標(biāo)均最佳。

所選氮源對Bb-Y03菌株效果優(yōu)良，從萌發(fā)率分析有機(jī)氮源之間均無顯著差異(P>0.05)，但顯著高于無機(jī)氮源(P<0.05)。從生長速率分析牛肉膏和酵母浸粉之間無顯著差異；從產(chǎn)孢量上分析牛肉膏和蛋白胨之間無顯著差異，但均顯著低于酵母浸粉。其中酵母浸粉菌絲生長速率和產(chǎn)孢量分別為(2.88±0.00) mm/d、(1.00±0.00)×108個/mL，在這兩項(xiàng)指標(biāo)中均處首位。

有機(jī)氮源的3個菌株菌落呈乳黃色棉絮狀，菌落較厚，有放射溝，同心環(huán)明顯，無機(jī)氮源的均呈現(xiàn)白色粉狀、有同心環(huán)、無褶皺，菌落薄。

以上結(jié)果表明，試驗(yàn)所選的有機(jī)氮源和無機(jī)氮源不僅適合內(nèi)蒙古自治區(qū)草地螟白僵菌的生長，而且效果良好。從形態(tài)特征上分析接種有機(jī)氮源上的菌株，一般菌落顏色較深較厚，多呈現(xiàn)乳黃色。無機(jī)氮源的菌落多呈現(xiàn)白色粉狀或絨毛狀，菌落厚度低于有機(jī)氮源。從生長指標(biāo)上分析，球孢白僵菌菌株之間存在的差異可能導(dǎo)致菌絲生長快但產(chǎn)孢量卻不一定高的現(xiàn)象?？傮w來看，有機(jī)氮源比無機(jī)氮源的萌發(fā)率高、菌絲生長快、產(chǎn)孢量高，其中以酵母浸粉的利用最為充分。綜合分析各菌株的形態(tài)特征和生長指標(biāo)可以得出：有機(jī)氮源酵母浸粉是該地區(qū)白僵菌菌株生長的最佳氮源，牛肉膏和蛋白胨次之。

2.3不同碳氮比對各菌株生長指標(biāo)的測定 3個菌株均可在12個不同碳氮比的培養(yǎng)基中生長，但在生長速度和產(chǎn)孢量上存在差異(表5、6)。菌株Bb-D01在編號2的培養(yǎng)基(C∶N=40∶8)的菌絲生長最快、產(chǎn)孢量最高，分別為(0.66±0.02) mm/d、(1.58±0.04)×108個/mL，C∶N為5∶1的編號7的培養(yǎng)基表現(xiàn)也相對較好，但顯著低于編號2(P<0.05)。

菌株Bb-S05以C∶N=5∶1(編號2、7和12)時利用率最佳。其中編號2的菌絲生長最佳、產(chǎn)孢量最高，顯著高于編號7和12(P<0.05)，且編號2的菌絲生長速度極顯著高于編號12的(P<0.01)，而編號7和12的菌絲生長和產(chǎn)孢量差異不顯著(P>0.05)。

菌株Bb-Y03在編號2、7和12三種培養(yǎng)基在菌絲生長和產(chǎn)孢量上相對其他要好，但三者之間差異不顯著(P>0.05)。其中以編號2的菌絲生長最好，為(0.60±0.05) cm/d、產(chǎn)孢量最高,為(1.55±0.04)×108個/mL。

2.4不同微量元素對Bb-D01、Bb-S05、Bb-Y03菌株生長指標(biāo)的測定 以葡萄糖和酵母浸粉為供試碳源和氮源，比例為5∶1，進(jìn)行不同微量量元素對3個菌株生長影響測定。從表7可知，Bb-D01、Bb-S05、Bb-Y03對微量元素的需求不同,微元素對3個菌株生長的作用與產(chǎn)孢量的影響均存在一定的差異。對Bb-D01而言，除單元素Cu2+對其菌落生長有抑制作用外，其余單元素菌對其均有促進(jìn)作用，F(xiàn)e3+、Mn2+組合和Fe3+對Bb-D01菌落生長有較大的促進(jìn)作用，相互間沒有顯著差異；從Bb-D01的產(chǎn)孢量看，除Cu2+、Zn2+、Fe3+組合外，其余組合及單元素對Bb-D01產(chǎn)孢量均無促進(jìn)作用。對Bb-S05而言，單元素對其菌落生長沒有促進(jìn)作用；Cu2+、Fe3+組合，F(xiàn)e3+、Zn2+、Mn2+組合促進(jìn)作用較大，并且Fe3+、Zn2+、Mn2+組合對其的促進(jìn)作用最大,但相互間沒有顯著差異；所有單元素及多元素組合對Bb-S05的產(chǎn)孢量有增產(chǎn)作用，其中單元素Fe3+增產(chǎn)效果最明顯。對Bb-Y03而言，添加任何單元素或多元素組合對其菌落生長均有抑制作用，尤其Cu2+、Fe3+、Zn2+、Mn2+組合對其抑制作用最大；從菌株產(chǎn)孢量的情況觀察，任何單元素或多元素組合對Bb-Y03菌落生長均有抑制作用。

表5 不同碳氮比對3株菌株菌絲生長的影響

表6 不同碳氮比對3株菌株產(chǎn)孢量的影響

表7 微量元素對3個菌株菌落生長和產(chǎn)孢量的影響

因此，綜合考慮各微量元素對菌落生長與產(chǎn)孢量影響的差異，實(shí)際生產(chǎn)中，對Bb-D01菌株可適當(dāng)添加Fe3+，應(yīng)盡量避免加入Cu2+；對Bb-S05、Bb-Y03菌株以不添加任何微量元素為佳。

3 討論與小結(jié)

營養(yǎng)條件是影響白僵菌菌株生長的重要因素之一，營養(yǎng)貧乏或缺失會導(dǎo)致菌株性狀的退化，造成菌落局變等現(xiàn)象，進(jìn)而影響真菌的活力。本研究分別選用4種碳源和4種氮源(無機(jī)碳源和無機(jī)氮源各一種)及12種不同碳氮比進(jìn)行初步分析，碳氮源的試驗(yàn)表明，不同的碳源或氮源對內(nèi)蒙古自治區(qū)東、西、中部地區(qū)白僵菌的影響顯著；不同的碳氮比試驗(yàn)中，對比例相同的配方來說，影響白僵菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的因素取決于各配方中碳源和氮源的含量而不是碳氮源的比例。

菌株對有機(jī)碳源的利用率高于無機(jī)碳源，個別菌株出現(xiàn)不能利用碳酸鈉的情況；各菌株對單糖和多糖均能很好的利用，這表明菌絲的淀粉水解酶活性很強(qiáng)，能夠順利地把淀粉水解為葡萄糖。葡萄糖作為碳源時菌株的形態(tài)特征表現(xiàn)優(yōu)良,各項(xiàng)生長指標(biāo)的參數(shù)最高，而陸晴等[12]研究認(rèn)為球孢白僵菌HFW-05菌株的最適碳源是蔗糖，原因可能是不同菌株所含的單糖水解酶和多糖水解酶水平不同，本研究所選取的球孢白僵菌菌株利用單糖的能力要大于利用多糖的能力。從經(jīng)濟(jì)方面考慮，淀粉的價(jià)格低于葡萄糖，同時菌株又具有較高的淀粉水解酶，所以在工業(yè)生產(chǎn)中可以利用各種植物淀粉作為碳源。

所有菌株均能在不同的氮源試驗(yàn)中正常生長。Peczynska Czoch和Urbanczyk[13]指出營養(yǎng)豐富的氮源可提高白僵菌的萌發(fā)及產(chǎn)孢水平,與本研究結(jié)果相符，其中以酵母浸粉的各項(xiàng)生長指標(biāo)最佳，利用率最高；牛肉膏和蛋白胨次之；無機(jī)氮源硝酸鉀最低，菌株對營養(yǎng)物質(zhì)吸收利用率也最低。

C∶N為5∶1時，菌株對營養(yǎng)物質(zhì)吸收利用率最高；其菌絲生長最快，產(chǎn)孢量最高。因此，C∶N=5∶1是該地區(qū)菌株的最佳配比。

目前微量元素對球孢白僵菌菌落生長發(fā)育影響的相關(guān)報(bào)道較少，本研究表明，只有Cu2+對Bb-D01菌落生長有抑制作用，而鄧春生等[14]在研究一種能寄生大黑鰓金龜子(Holotrichiaoblita)和暗黑鰓金龜子(B.tenella)的卵孢白僵菌(H.parallela)時，培養(yǎng)基中添加單元素Cu2+有利于“單5”菌株的生長，之所以出現(xiàn)結(jié)果不一致，可能的原因是本研究所選的是球孢白僵菌，而“單5”菌株所選的是卵孢白僵菌；二者的寄主不同，因此寄主體內(nèi)的微量元素Cu2+含量也有差異，這有待進(jìn)一步的研究。另外，Mn2+促進(jìn)Bb-D01菌落生長，卻抑制Bb-S05、Bb-Y03菌落生長；Mn2+降低了Bb-D01的產(chǎn)孢量，卻增加了Bb-S05、Bb-Y03的產(chǎn)孢量，這與楊珊珊[15]的添加高錳酸鉀能促進(jìn)白僵菌的產(chǎn)孢量的研究結(jié)果一致?？梢钥闯?，Mn2+在科學(xué)研究和實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)具體情況決定是否添加，如果需要增加Bb-S05、Bb-Y03的產(chǎn)飽量，可以在培養(yǎng)基中適量添加Mn2+。

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