李強(qiáng)棟，孟 林，毛培春，張德罡，韓潤英

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院北京草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心，北京 100097；3.內(nèi)蒙古通遼市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

馬藺(Irislacteavar.chinensis)系鳶尾科鳶尾屬多年生草本宿根植物，在我國北方各省區(qū)野生分布廣泛[1]。生長于河灘、鹽堿灘地，為鹽化低地草甸建群種[2]。根狀莖短而粗，根系入土深，須根稠密發(fā)達(dá)。花淡雅美麗，葉色青綠，柔軟厚實(shí)，病蟲害少。耐鹽堿，抗旱抗寒能力強(qiáng)，耐粗放管理。近年來，在我國逐漸被用于恢復(fù)生態(tài)、水土保持及園林綠化方面，是鹽堿地改良、城市綠地建植、防風(fēng)固沙、公路護(hù)坡和堤壩坡綠化的理想材料；同時(shí)，馬藺在藥用、飼用和經(jīng)濟(jì)植物資源方面也具有一定的開發(fā)價(jià)值[3-5]。在不同生境分布的馬藺種質(zhì)材料，種子形態(tài)和顏色、葉寬及長度、花色及花莖長度等性狀均表現(xiàn)出明顯差異，種質(zhì)材料間必然存在豐富的遺傳多樣性。

本研究采用非連續(xù)垂直聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，檢測收集自我國北方野生分布的23份馬藺種質(zhì)材料的POD同工酶，探討不同居群馬藺種質(zhì)材料間遺傳變異與親緣關(guān)系，為馬藺種質(zhì)資源的開發(fā)利用提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 以采自我國北方5省區(qū)不同生境分布的23份馬藺種質(zhì)為試驗(yàn)材料，材料編號、生境、來源和地理信息詳見表1。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1幼苗培養(yǎng) 于2009年11月在北京市農(nóng)林科學(xué)院草業(yè)中心日光溫室進(jìn)行。在花盆(內(nèi)口徑21 cm，高18 cm)中裝入3 kg草炭土(依體積比加入過篩土2份，草炭1份)，每個(gè)種質(zhì)材料設(shè)4次重復(fù)，每重復(fù)50粒種子。待生長到4～5片真葉時(shí)采樣[4]。

表1 馬藺種質(zhì)材料

1.2.2酶液提取 剪取從外向內(nèi)數(shù)第3片馬藺幼苗功能葉尖部0.1 g，加入1.5 mL樣品緩沖液(內(nèi)含0.065 mol/L Tris-檸檬酸,pH值8.2)，剪碎后于冰浴中研磨，研磨后將勻漿迅速倒入離心管，12 000 r/min離心5 min，取上清液1 mL加入0.25 mL 50%甘油(內(nèi)含2%溴酚藍(lán))溶液混勻后，放入4 ℃冰箱以備同工酶檢測。

1.2.3制備凝膠 參考何忠效和張樹政[14]的方法，采用高pH-不連續(xù)電泳凝膠體系，分離凝膠濃度為7.5%,0.65 mol/L Tris-HCl(pH值8.8)緩沖液;濃縮凝膠濃度為3%,0.125 mol/L Tris-HCl(pH值6.8)緩沖液。

1.2.4電泳 用微量進(jìn)樣器吸取0.02 mL酶液，加入點(diǎn)樣槽，向電極槽內(nèi)注入電極緩沖液，接通電源穩(wěn)壓電泳。當(dāng)前沿指示劑從濃縮凝膠進(jìn)入分離凝膠時(shí)，將電壓由150 V調(diào)至200 V。

1.2.5染色 采用改良聯(lián)苯胺法染色[15]。脫色后在凝膠成像系統(tǒng)上掃描同工酶雙波長圖譜峰值，選擇清晰、短促、整齊的膠板拍照。重復(fù)5次，選取譜帶最清晰的膠板做進(jìn)一步分析。

1.3數(shù)據(jù)處理

1.3.1酶活性 電泳膠板經(jīng)過染色后，凝膠譜帶的顏色深淺反映POD同工酶活性的強(qiáng)弱。根據(jù)譜帶顏色深淺程度的不同，將酶活性強(qiáng)弱劃分為4級。4級：譜帶顏色深，酶活性強(qiáng)；3級：譜帶顏色較深，酶活性較強(qiáng)；2級：譜帶顏色淺，酶活性弱；1級：譜帶顏色最淺，酶活性最弱。

1.3.2電泳遷移率 計(jì)算各個(gè)譜帶的遷移率(Rf)=X1/X2，式中,X1為固定染色后凝膠中蛋白質(zhì)譜帶的遷移距離；X2為固定染色前凝膠中指示劑遷移距離[16]。同時(shí)，參考酶活性分類等級繪制酶譜模式圖。

1.3.3統(tǒng)計(jì)分析 用二元屬性法將電泳所得膠板的帶型視為一個(gè)形態(tài)性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，具有多態(tài)性帶出現(xiàn)的賦值為“1”，無帶為“0”，數(shù)據(jù)輸入NTSYSpc 2.1軟件計(jì)算相似性系數(shù)并獲得相似性系數(shù)矩陣，用非加權(quán)組平均法(UPGMA)方法進(jìn)行聚類分析并生成聚類圖[10,17]。

2 結(jié)果

2.1POD同工酶電泳結(jié)果 不同生境分布的23份馬藺種質(zhì)材料POD同工酶譜帶差異性較大，譜帶濃度和擴(kuò)散程度也不同(圖1)。靠近陰極區(qū)域附近的譜帶形成顏色較深、濃度較大和擴(kuò)散程度大的譜帶；靠近正極區(qū)域附近的譜帶形成顏色較淺、濃度較小和擴(kuò)散程度小的譜帶；處于中間區(qū)域的譜帶表現(xiàn)出兩極區(qū)域譜帶共有特征，強(qiáng)弱帶多樣分布、譜帶濃度從4至1級變化豐富，初步說明POD同工酶具有較高的多態(tài)性。

2.2POD同工酶譜帶特征 由酶譜模式圖分析(圖2)，23份野生馬藺種質(zhì)材料共出現(xiàn)30條譜帶，各種質(zhì)材料中出現(xiàn)9條、8條、7條、6條及5條譜帶，分別占供試種質(zhì)材料的8.7%、34.8%、13.0%、26.1%和17.4%，其中，種質(zhì)材料BJCY-ML004和BJCY-ML024譜帶數(shù)最多(9條)，BJCY-ML001、BJCY-ML018、BJCY-ML021和BJCY-ML29譜帶數(shù)最少(5條)。Rf在0.041～0.515位點(diǎn)多態(tài)分布，而Rf在0.041位點(diǎn)，BJCY-ML012、BJCY-ML013、BJCY-ML014和BJCY-ML020未檢測出同工酶譜帶，占全部材料的17.4%，其余材料檢測出的譜帶顏色深，活性等級為4與3，表現(xiàn)出強(qiáng)酶活性，多態(tài)性強(qiáng)的特征；Rf在0.515位點(diǎn)，僅BJCY-ML004出現(xiàn)酶譜帶，為其特征譜帶。

圖1 23份馬藺種質(zhì)材料POD同工酶酶譜

圖2 23份馬藺種質(zhì)材料POD同工酶酶譜模式圖

根據(jù)Rf值，將電泳膠板上分布的酶譜帶劃分為4區(qū)(由陰極到陽極)，各區(qū)Rf范圍及出現(xiàn)的種質(zhì)材料見表2。參試的23份種質(zhì)材料的Rf不完全相同，大部分酶活性強(qiáng)譜帶和較強(qiáng)譜帶集中在A區(qū)和B區(qū)，各個(gè)材料譜帶數(shù)及酶活性強(qiáng)弱差別較大，由此，通過基因在酶蛋白上的表達(dá)反映了種質(zhì)材料的遺傳特性，初步說明了供試的野生馬藺種質(zhì)材料存在遺傳差異性。其中：A區(qū)(Rf=0.000～0.061)，僅Rf在0.041位點(diǎn)出現(xiàn)譜帶，檢測出譜帶的種質(zhì)材料占全部材料82.6%，應(yīng)為馬藺的共有譜帶。同時(shí)，在Rf0.041位點(diǎn)，材料BJCY-ML015譜帶顏色淺，活性2級，表現(xiàn)出弱酶活性；材料BJCY-ML011譜帶顏色較深，酶活性3級，表現(xiàn)出較強(qiáng)酶活性；其余材料酶活性顏色深，活性4級，表現(xiàn)出強(qiáng)酶活性。

B區(qū)(Rf=0.061～0.258)，10個(gè)遷移率位點(diǎn)檢測出譜帶，Rf為0.165、0.216出現(xiàn)譜帶頻率均為70%以上，譜帶出現(xiàn)幾率高，應(yīng)為馬藺的共有酶譜帶。其中，僅BJCY-ML004在Rf0.227位點(diǎn)出現(xiàn)譜帶，其顏色較深，酶活性較強(qiáng)，分類等級3，出現(xiàn)頻率僅為4%，為BJCY-ML004特征譜帶(出現(xiàn)頻率≤5%)，其余材料Rf在0.082～0.216之間，占全部材料的9%～43%。同時(shí)，在B區(qū)檢測到的譜帶數(shù)變化豐富，最多為4條，如BJCY-ML004、BJCY-ML012、BJCY-ML013和BJCY-ML023等；最少為2條，如BJCY-ML001、BJCY-ML005、BJCY-ML006和BJCY-ML018等，顯示出POD同工酶在馬藺種質(zhì)資源個(gè)體間存在較大遺傳差異性。

表2 酶譜分區(qū)

C區(qū)(Rf=0.258～0.453)，共15個(gè)遷移率位點(diǎn)檢測出譜帶，在Rf0.289、0.325、0.345、0.361、0.392、0.402和0.433位點(diǎn)出現(xiàn)譜帶的頻率分別為70%、17%、52%、30%、39%、13%和39%，出現(xiàn)頻率高，應(yīng)為馬藺的共有譜帶。在Rf0.299、0.314、0.332、0.368、0.371、0.387、0.418和0.428位點(diǎn)，譜帶出現(xiàn)頻率僅為4%，譜帶酶活性呈現(xiàn)弱及最弱，其中BJCY-ML005呈現(xiàn)3條特征酶帶，BJCY-ML006存在2條特征酶帶，BJCY-ML011、BJCY-ML018和BJCY-ML020各有1條特征酶帶。

D區(qū)(Rf=0.453～0.557)，共4個(gè)遷移率位點(diǎn)檢測出譜帶，在Rf0.464、0.505和0.515檢測出酶譜的材料占所有供試材料的4%，酶活性呈現(xiàn)弱及最弱，分類等級1、2級，為BJCY-ML004、BJCY-ML005和BJCY-ML033的特征酶帶。BJCY-ML006和BJCY-ML 033分別在遷移率0.485位點(diǎn)檢測到酶帶，酶活性最弱及弱，分類等級1、2級。顯示出不同生境條件下野生分布的馬藺種質(zhì)具有豐富的遺傳多樣性，存在一定的親緣關(guān)系。

2.3聚類分析 相似性系數(shù)可反映不同生境和地理位置的種質(zhì)材料間親緣關(guān)系[18]。將譜帶轉(zhuǎn)化為二元屬性數(shù)據(jù)，并計(jì)算得到相似性系數(shù)矩陣(表3)。馬藺POD同工酶相似性系數(shù)普遍偏大，為0.516～1.000。其中，BJCY-ML004和 BJCY-ML020間相似性系數(shù)最小(0.516)，BJCY-ML028和BJCY-ML031間相似性系數(shù)最大(1.000)，其他材料間的相似性系數(shù)為0.548～0.968。根據(jù)聚類結(jié)果(圖3)，以相似性水平0.71為判定標(biāo)準(zhǔn)，將供試的23份馬藺種質(zhì)劃分為4個(gè)一級類群。第Ⅰ類群，共15份種質(zhì)，再以相似性水平0.76為標(biāo)準(zhǔn)，又可劃分為3個(gè)亞類群，其中第一亞類群包括BJCY-ML001、BJCY-ML018和BJCY-ML008；第二亞類群包括BJCY-ML021、BJCY-ML027、BJCY-ML029、BJCY-ML028、BJCY-ML031、BJCY-ML035、BJCY-ML022、BJCY-ML026、BJCY-ML023、BJCY-ML024和BJCY-ML033；第三亞類群包括BJCY-ML005。第Ⅱ類群包括BJCY-ML006和BJCY-ML011。第Ⅲ類群包括BJCY-ML004。第Ⅳ類群包括5份材料，當(dāng)相似性水平大于0.79時(shí)，可劃分為2個(gè)亞類群，即BJCY-ML012和BJCY-ML013屬第一亞類群；BJCY-ML014、BJCY-ML015和BJCY-ML020屬第二亞類群。聚類結(jié)果反映了不同居群馬藺種質(zhì)材料與其生境或地理位置存在一定相關(guān)關(guān)系。

圖3 聚類分析

3 討論

通過基因產(chǎn)物檢測等位基因和基因特定結(jié)構(gòu)，進(jìn)而從宏觀上探討了微觀結(jié)構(gòu)，可在一定程度上揭示植物系統(tǒng)發(fā)生和親緣關(guān)系[19]。通過對不同居群馬藺種質(zhì)資源進(jìn)行生化、分子水平上的研究，為馬藺遺傳多樣性研究提供理論依據(jù)。目前關(guān)于馬藺的研究主要集中于生物學(xué)特性與生態(tài)地理分布、資源和經(jīng)濟(jì)用途綜合論述、栽培技術(shù)、破除種子硬實(shí)提高發(fā)芽率的技術(shù)、抗旱性鑒定、組織培養(yǎng)等的研究上[20-25]，對其眾多形態(tài)變異類型相關(guān)的遺傳變異研究報(bào)道較少。DNA分子水平上，采用ALFP技術(shù)和ISSR技術(shù)分別開展了不同生境條件下野生分布的馬藺種質(zhì)資源分子遺傳多樣性分析的研究[26-27]，證明了馬藺種質(zhì)材料間存在豐富的遺傳多樣性，而從生化水平上，研究不同生境條件下馬藺種質(zhì)材料間同工酶酶譜特征的遺傳變異特性相對較少。另一方面，采用酶電泳技術(shù)可以較為容易的計(jì)量近緣生物之間遺傳變化，并同時(shí)比較多種蛋白質(zhì)。本研究譜帶濃度變化豐富及部分種質(zhì)資源特征譜帶的出現(xiàn)，即表明馬藺體內(nèi)酶蛋白協(xié)同多種同工酶適應(yīng)不同生境，發(fā)生了一定的遺傳變異，表現(xiàn)出遺傳多樣性。本研究中23份野生馬藺種質(zhì)共出現(xiàn)30個(gè)遷移率位點(diǎn)，4個(gè)酶譜濃度分級，各種質(zhì)材料中出現(xiàn)9條、8條、7條、6條和5條譜帶，遷移率在0.041～0.515位點(diǎn)多態(tài)分布。通過譜帶分析，在A區(qū)0.041位點(diǎn)檢測出了82.6%試驗(yàn)材料全部所具有的基本譜帶，說明不同居群下馬藺種質(zhì)材料具有共同起源，其他3區(qū)總共出現(xiàn)12條多態(tài)性特征譜帶(BJCY-ML004和BJCY-ML006,各2條;BJCY-ML005,4條;BJCY-ML011、BJCY-ML018、BJCY-ML020和BJCY-ML033，各1條)。植物受不同生境條件影響，遺傳分子水平發(fā)生變異，從而導(dǎo)致同工酶水平發(fā)生相應(yīng)的遺傳差異[28]。POD同工酶在植物不同組織器官、不同發(fā)育階段廣泛存在并參與體內(nèi)多種生理活動(dòng)，是一種重要的遺傳標(biāo)記信息[13,29]。

表3 馬藺種質(zhì)材料POD同工酶相似性系數(shù)矩陣

全部種質(zhì)之間的相似性系數(shù)值在0.516～1.000，BJCY-ML004和BJCY-ML020具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，二者的相似性系數(shù)最小，為0.516，遺傳差異較大，在探討馬藺起源和演化、種質(zhì)材料間親緣關(guān)系和系統(tǒng)分類方面，可以作為種質(zhì)資源收集、創(chuàng)新和改良的選擇基礎(chǔ)。聚類分析是數(shù)理統(tǒng)計(jì)研究中的一種多元分析方法，通過“物以類聚”的思想方法，分析物與物之間的相同點(diǎn)和類與類之間的差異，定量地確定類群或相關(guān)指標(biāo)的親疏關(guān)系，從而客觀地分型劃類[30-31]。本研究以POD同工酶相似性系數(shù)聚類得到樹狀聚類圖，將23份野生馬藺種質(zhì)資源劃分為四大類群，所有材料表現(xiàn)出的類群間差異大于類群內(nèi)差異,這僅僅是從單一的POD同工酶譜帶的特征觀察描述而得，如BJCY-ML021與BJCY-ML027，BJCY-ML022與BJCY-ML026，BJCY-ML012與BJCY-ML013的聚類結(jié)果均顯示出與其分布地理位置和生境存在一定的關(guān)系。該方法應(yīng)用于野生馬藺種質(zhì)資源的數(shù)量分類，結(jié)合相似性系數(shù)大小，在一定程度上可評價(jià)其親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，揭示其遺傳背景的差異。同時(shí)，尚需進(jìn)一步從形態(tài)學(xué)、生化學(xué)和DNA分子標(biāo)記的角度，綜合分析其遺傳多樣性，揭示其親緣關(guān)系和遺傳特性，為馬藺優(yōu)異種質(zhì)資源的開發(fā)利用提供更為科學(xué)客觀的理論基礎(chǔ)。

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