李必富，王曉佳，楊金福，湯 承

(西南民族大學生命科學與技術學院，動物醫(yī)學四川省高等院校重點建設實驗室，四川成都610041)

犬皮膚真菌病是寄生于犬被毛與表皮、趾爪角質蛋白組織中的真菌引起的以皮膚瘙癢、紅斑性脫毛、丘疹、膿包、結痂、皮屑等為特征的各種皮膚病.它是一種人畜共患病，可通過直接和間接接觸傳播給人類.近年來中國寵物犬的飼養(yǎng)數量大幅增加，犬源皮膚真菌通過接觸感染人的機會大大增加，犬已經成為人真菌病的重要傳染源.寵物病原真菌主要是小孢子屬和毛癬菌屬成員［1］，目前國內報道犬的真菌性皮膚病中絲狀真菌的感染率最高，其病原體70%是犬小孢子菌，20%是石膏樣小孢子菌，10%是須發(fā)毛癬菌［2］，尚未見致病性黑曲霉菌的研究報告.國內目前對動物病原真菌的鑒定主要是采用分離培養(yǎng)及形態(tài)學鑒定，但該方法對形態(tài)相近的真菌難以準確鑒別，而分子鑒定則顯示出其巨大的優(yōu)勢.真菌在rDNA-ITSA區(qū)段既具有保守性，又在屬間及種間存在廣泛的多態(tài)性，利用這一特性進行PCR擴增及序列分析已經廣泛應用于動植物病原真菌鑒定.作者從皮膚病患犬病灶中分離出一株真菌，經核糖體轉錄間隔區(qū)(rDNA-ITS)基因克隆測序鑒定為黑曲霉，并對其培養(yǎng)特性、耐藥性及致病性等生物學特性進行了研究，為犬源真菌病的診療提供參考.

1 材料與方法

1.1 臨床病例和小鼠

2歲棕色雄性貴賓犬，表現為皮膚瘙癢，背部和尾部脫毛、皮膚出現紅色丘疹.成年雄性昆明鼠購自四川大學實驗動物中心.

1.2 培養(yǎng)基和試劑

PCR Master Mix購自天根生物有限公司;JM109感受態(tài)細胞購自奧克公司;PMD19載體購自日本TaKaRa公司;膠回收試劑盒購自天根生物有限公司.地塞米松由鄭州卓峰制藥廠生產，沙堡培養(yǎng)基和兩性霉素B、伊曲康唑膠囊、酮康唑、制霉菌素、氟康唑等5種抗真菌藥敏紙片購自杭州微生物制品有限公司.

1.3 引物

參照文獻［3］設計的位于18 S區(qū)域的上游引物和文獻［4］設計的位于28 S區(qū)域的下游引物，擴增包含真菌 rDNA 18 S和28 S的部分區(qū)域和ITS1，5.8 S，ITS2 的完整區(qū)域的片段，上下游引物序列為:5’-tccgtaggtgaacctgcgc-3’，5’-tcctccgcttattgatatgc-3’，引物由上海生物工程公司合成.

1.4 真菌分離培養(yǎng)及形態(tài)學觀察

將患部用酒精仔細清潔消毒后用刀片刮取患部皮屑和組織，接種于沙堡平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)1周，觀察菌落特征，并將分離出的真菌采用載片培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)72 h，觀察菌體形態(tài).

1.5 ITS區(qū)的PCR擴增

收集沙堡平板72 h真菌培養(yǎng)物，加入液氮研磨，用酚-氯仿法提取真菌總DNA，進行ITS區(qū)的PCR 擴增.體系:PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各 1 μL，DNA 模版1 μL，無菌水補足至25μL.擴增反應條件為:95℃ 7 min，95 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1 min 30 s，35 個循環(huán);72℃10 min;16℃保存;結束反應.PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統成像觀察電泳結果.

1.6 克隆測序及系統發(fā)育分析

按照膠回收試劑盒說明書將擴增片段進行純化，連接T載體并轉入JM109感受態(tài)細胞，陽性克隆送上海英俊公司測序.用DNAStar 7.1.0版DNA分析軟件中的MegAlign軟件對ITS區(qū)基因序列進行同源性比較和系統發(fā)育分析，自舉值為1 000.

1.7 藥敏試驗

將孢子濃度為1×106CFU·mL-1的真菌涂布于沙堡平板培養(yǎng)基，并將藥敏片平貼于培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h，測定抑菌圈大小，并按照說明書提供的標準判斷其對藥物的敏感性(表1).

表1 抑菌圈判定標準Table1 Interpretation of the standard zone of inhibition

1.8 致病性試驗

參照文獻［5，6］報道的方法，12只小鼠首先肌肉注射地塞米松，0.2 g·只-1，連續(xù)注射8 d，使小鼠處于免疫抑制狀態(tài).隨后將小鼠分為3組，每組3只，第1組經腹腔注射途徑感染，5×105CFU·只-1，第2組經皮膚感染，具體做法是首先將小鼠背部刮毛，大小約為2 cm2，再用刀片刮無毛區(qū)皮膚至輕微破損，立即用蘸取真菌孢子的棉簽涂抹，5×105CFU·只-1，第3，4組以生理鹽水代替真菌孢子分別經腹腔和皮膚進行處理，作為空白對照組.隔離飼養(yǎng)于SPF鼠籠中，觀察記錄小鼠的臨床癥狀及病理變化至第4周，并于試驗結束后撲殺小鼠，觀察皮膚及內臟病變，采集病料進行真菌分離培養(yǎng).

2 結果與分析

2.1 真菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)特性

在沙堡瓊脂平板上37℃ 24 h可見白色絨毛狀菌落，以后迅速蔓延，菌絲體為白色，48 h達到孢子成熟階段，隨著孢子的形成而逐漸變?yōu)橹醒氤屎谏窠q狀菌落，中心可見孢子形成的黑色顆粒，有環(huán)狀溝紋;載片培養(yǎng)物鏡檢可見菌絲發(fā)達而多分枝，頂端可見大球型頂囊，分生孢子頭呈黑褐色放射狀宛若“菊花”(圖1)，為典型的黑曲霉菌落及形態(tài)特征.

圖1 黑曲霉的菌落及菌體特征Fig.1 The colony and morphological characteristics of Aspergillus niger

2.2 r DNA-ITS區(qū)的鑒定結果

從真菌分離株(SC-8)中擴增出1條約600 bp的條帶(圖2)，測序結果顯示擴增片段大小為599 bp，與GenBank中的黑曲霉ITS區(qū)基因序列的同源性為94.1% ～100%(圖3)，是黑曲霉的特異片段，證實分離菌株為黑曲霉(Aspergillus niger SC-8).

系統發(fā)育分析表明，Aspergillus niger SC-8和巴西人源分離株(FJ810501)以及意大利人源分離株(GQ359407)聚為1支(圖4).

2.3 藥敏試驗結果

Aspergillus niger SC-8對兩性霉素和制霉菌素高度敏感，對酮康唑中度敏感，而對氟康唑和伊曲康唑耐藥.

圖2 真菌分離株的PCR鑒定結果Fig.2 The results of PCR identification of Aspergillus niger

2.4 致病性

以生理鹽水處理的小鼠在試驗期間精神、食欲正常，被毛光順，皮膚出現瘙癢和紅腫現象.而經皮膚和經腹腔感染小鼠各有1只出現皮膚瘙癢、發(fā)紅、滲出和脫毛現象，與犬自然感染病變相似(圖5).剖檢可見該小鼠脾臟有白色霉菌結節(jié)(圖6)，從該部位和患部皮膚均分離出真菌，經PCR擴增和測序證實為黑曲霉.

3 討論

本研究從皮膚病患犬分離出真菌，經過rDNAITS基因序列測定和動物試驗，確診該犬的皮膚病是由黑曲霉引起的.曲霉菌感染可引起人和動物的淺部真菌?。?］，ELAD 等［7］還發(fā)現土曲美可引起犬的彌散性真菌病.而深部感染的報道并不多見，國內尚未見黑曲霉感染犬的報道.真菌多為條件性致病菌，常于機體免疫功能低下時繼發(fā)感染或與其他病原混合感染，加重病情，增加死亡率.近年來，中國人和動物的免疫缺陷性疾病發(fā)病率不斷升高，隨著中國寵物養(yǎng)殖數量的不斷增長，犬只與人類的接觸更為密切，感染人的機會大大增大，犬已經成為人類真菌性皮膚病的重要傳染來源.本研究發(fā)現犬源黑曲霉rDNA-ITS基因與人源黑曲霉具有高度的同源性，且對制霉菌素和兩性霉素具有耐藥性，其公共衛(wèi)生學意義值得關注.

基于ITS間隔區(qū)的片段序列擴增及序列測定可準確鑒定動物病原真菌.西南民族大學動物醫(yī)學四川省高等院校重點建設實驗室通過對不同研究報告中的上下游引物序列進行優(yōu)化組合，擴增真菌rDNA-ITS區(qū)約599 bp的片段，通過測序和序列分析，將該實驗室分離的41株犬源皮膚真菌分為15個屬，16個真菌小種，其中3株為黑曲霉菌［8］.證明基于ITS區(qū)序列的分子鑒定技術對犬源真菌的鑒定廣泛適用.

［1］ 于 湘，周德壯，林宏亮，等.淺談犬真菌病與螨蟲病的鑒別診斷［J］.湖北畜牧獸醫(yī)，2010(3):27-28.

［2］ 張士霞，王洪斌，肖建華.國內犬皮膚病流行現狀及診治方法［J］.吉林畜牧獸醫(yī)，2008，29(1):61-62.

［3］ GARDESM，BRUNST D.ITSprimer with enhanceds specificity for basidiomycetes:application to the identification of mycorrizae-andrusts［J］.Mol Ecol，1993(2):113-118.

［4］ SHIANG N L，HSIEN CC，HSIAOF S ，et al.Identification of medically important yeast species by sequence analysis of the internal transcribed spacer regions［J］.J Clin Microbiol，2006，44(3):693-699.

［5］ 李 杰，施文琴，林德貴.犬小孢子菌感染豚鼠皮膚引起的郎格罕氏細胞的變化［J］.中國獸醫(yī)雜志，2007，43(11):27-28.

［6］ 柴 寶，劉 軍，呂桂霞，等.裴氏著色真菌致病性的動物實驗研究［J］.中國皮膚性病學雜志，2004，18(9):518-522.

［7］ ELAD D，LAHAV D，BLUM S.Transuterine transmission of Aspergillus terreus in a case of disseminated canine aspergillosis［J］.Med Mycol，2008，46(2):175-178.

［8］ 王曉佳.真菌DNA提取方法研究和犬源真菌分子鑒定［D］.成都:西南民族大學，2007.