桑葉子，孫 明，2，張啟翔，2

(1.北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，北京100083;2.國家花卉工程技術(shù)研究中心，北京100083)

植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的建立是分離次生代謝產(chǎn)物、進(jìn)行原生質(zhì)體融合與遺傳轉(zhuǎn)化的重要基礎(chǔ)工作，同時(shí)亦可用于植物抗性生理的研究及各種生理生化指標(biāo)的測(cè)定，還可作為誘變的對(duì)象，減少嵌合體的產(chǎn)生［1，2］.迄今，木本植物香花槐［3］、毛泡桐［4］，藥用植物紅景天［5］及一些觀賞植物高羊茅、石竹、一品紅、薰衣草［6～9］等都已成功建立細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，該體系在荔枝和龍眼［10］上實(shí)現(xiàn)了作為轉(zhuǎn)基因受體的功能.但菊科植物只有栽培品種小菊建立了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系［11］，但野生種鮮有報(bào)道.太行菊(Opisthopappus taihangensis)是菊科菊蒿亞族太行菊屬多年生宿根草本植物，是中國的特有種，分布在山西(陵川、晉城)、河南(濟(jì)源).太行菊生于海拔300 m以上的石壁或裸露的石礫坡地上.其植株低矮，耐干旱、瘠薄，抗逆性很強(qiáng)，并且植株具有一種獨(dú)特的香氣，作為地被植物在園林中推廣應(yīng)用具有可觀的前景.太行菊屬與菊科其他屬的二倍體野生種雜交親和性較好，這使得通過體細(xì)胞融合獲得屬間雜種的可能性大大提高.因此在遺傳育種和園林應(yīng)用上太行菊都具有很高的研究價(jià)值［12，13］.本研究以太行菊作為試材，探索建立細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的方法，以期為遺傳轉(zhuǎn)化、誘變育種奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

太行菊采自河北太行山區(qū)，在北京林大林業(yè)科技股份有限公司PC板雙坡面連棟加溫溫室培養(yǎng)保存.

1.2 方法

1.2.1 無菌苗的獲得 采健康無病蟲害、生長勢(shì)健壯的植株，修剪成帶1～2個(gè)腋芽的莖段.流水沖洗30 min后在體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇中浸泡30 s，沖洗干凈再加入吐溫的0.1%氯化汞處理3.5 min，最后用無菌水沖洗4遍.接種到1/2 MS培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)腋芽萌發(fā).每3周繼代1次.培養(yǎng)條件為25℃，16 h/8 h光周期.

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選 將無菌苗的葉片剪去，莖段剪成約3～5 mm(不帶腋芽)的小段，橫放在培養(yǎng)基上.根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，采用3因素3水平的正交設(shè)計(jì)培養(yǎng)基，配方如表1所示.

表1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table1 Orthogonal design of callus induction

每瓶培養(yǎng)基中放入10根莖段，每個(gè)處理重復(fù)3次.每10 d觀察1次，4 d后統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率、死亡率和愈傷組織生長狀態(tài).普通拍照采用CANON IXUS50拍攝，顯微觀察及照相采用LEICA S8AP0體視顯微鏡和ZEISSPrimo Star顯微鏡.

愈傷誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)愈傷的外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，將不同外觀的愈傷組織同解剖結(jié)構(gòu)聯(lián)系起來，最終將愈傷組織根據(jù)軟硬程度分為5級(jí)［11］，做為評(píng)價(jià)愈傷組織生長狀態(tài)的指標(biāo).1級(jí):疏松呈水漬狀膨大，黃色愈傷組織，用解剖針挑破會(huì)有汁液滲出;2級(jí):疏松表面有顆粒感，黃綠色愈傷組織，用鑷子可以輕易從表面剝離成若干小球狀顆粒;3級(jí):軟，綠色愈傷組織表面有顆粒感，用鑷子解剖針挑開內(nèi)部無褐化;4級(jí):硬，綠色愈傷組織表面緊實(shí)，用手術(shù)刀切開，接近培養(yǎng)基部分褐化泛黃;5級(jí):堅(jiān)硬，綠色愈傷組織表面干硬泛白，用手術(shù)刀切開，且內(nèi)部發(fā)黑.

1.2.3 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基的篩選 將在1.2.2中篩選的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的愈傷組織放入液體培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮培養(yǎng).懸浮培養(yǎng)基根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，采用3因素3水平的正交設(shè)計(jì)培養(yǎng)基，配方如表2所示.

表2 液體培養(yǎng)基正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table2 Orthogonal design of liquid medium

將愈傷組織切碎后稱重，放入100 mL三角瓶中，每瓶加入50 mL液體培養(yǎng)基.培養(yǎng)條件為:搖床轉(zhuǎn)速100 r·min-1，(25±1)℃，弱光.每2 d對(duì)懸浮細(xì)胞進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)，懸浮液用60目分樣篩(孔徑為250μm)尼龍網(wǎng)過濾，取混勻的細(xì)胞懸浮液1 mL，在其中抽取40μL進(jìn)行顯微計(jì)數(shù)，平行測(cè)定3次，連續(xù)觀察10 d.

細(xì)胞懸浮液濃度=(40μL懸浮細(xì)胞液中細(xì)胞個(gè)數(shù)/40)×1000

測(cè)量指標(biāo):細(xì)胞懸浮液濃度.以每毫升懸浮細(xì)胞液中單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)的密度作為衡量懸浮細(xì)胞生長速率的指標(biāo).

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選

太行菊試管苗比地被菊等其他品種的菊花生長勢(shì)較弱莖稈纖細(xì)，且容易蓮座化，這個(gè)問題普遍存在，通過改良培養(yǎng)基配方也很難解決.因此誘導(dǎo)愈傷的過程中一部分會(huì)自然枯黃、褐化，但是存活的外植體愈傷誘導(dǎo)率很高，添加不同的激素對(duì)愈傷組織的生長狀態(tài)有較大影響.

表3 不同培養(yǎng)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table3 The effect of different medium to the induction of callus

由表3得知，a培養(yǎng)基單純添加細(xì)胞分裂素，導(dǎo)致外植體較快的褐化死亡;而b，e培養(yǎng)基細(xì)胞分裂素與生長素添加質(zhì)量濃度的比值相當(dāng)，此時(shí)愈傷組織多質(zhì)地疏松偏黃，部分呈水漬狀;而d，h培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素比重大于生長素2～3倍，愈傷組織偏綠色質(zhì)地硬實(shí)不宜分散.g，i培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素比重大于生長素1倍左右時(shí)，愈傷組織生長狀況比較適中，排列緊密質(zhì)地松軟.

表4 愈傷組織誘導(dǎo)正交試驗(yàn)的極差分析Table4 Variance analysis of callus induction orthogonal design

從表4可以看出，3個(gè)因素處理間差異均顯著.第3因素2，4-D質(zhì)量濃度的極差最大，其次是第1因素6-BA質(zhì)量濃度，說明太行菊以莖段為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)受到生長素2，4-D質(zhì)量濃度的影響最大，其次是細(xì)胞分裂素6-BA的質(zhì)量濃度.從平均值看，第1因素的第3水平最好，第2因素的第2水平最好，第3因素的第3水平最好.所以各因素最好的搭配是MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+2，4-D 1.0 mg·L-1.

通過對(duì)愈傷組織生長狀態(tài)的連續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，由莖段誘導(dǎo)太行菊愈傷組織，接種4 d后可見兩端切口處增大，10 d以后莖段兩端開始膨大，產(chǎn)生黃色的愈傷組織，20 d后外植體表面全部覆蓋愈傷組織，40 d后產(chǎn)生大量愈傷組織外植體呈球狀體如圖1所示.體視顯微鏡下解剖發(fā)現(xiàn)(圖2)，球狀體表面覆蓋著一層綠色的愈傷組織，并有少量分化的芽點(diǎn)，內(nèi)部成黃綠色的愈傷組織排列緊密，但質(zhì)地松軟，表面細(xì)胞呈球形，類似胚性愈傷組織.

2.2 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)基篩選

2.2.1 正交試驗(yàn)的極差分析 從表5可以看出，第3因素接種量的極差最大，其次是第1因素2，4-D的質(zhì)量濃度，說明細(xì)胞懸浮培養(yǎng)初期細(xì)胞團(tuán)的個(gè)數(shù)受到接種量的影響最大，其次是生長素的質(zhì)量濃度.從平均值看，第1因素的第1水平最好，第2因素的第3水平最好，第3因素的第3水平最好.所以各因素最好的搭配組合是MS+2，4-D 0.5 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1+ 接種量 40 g·L-1.在0.05水平上，第1因素和第3因素處理間差異顯著，其余均不顯著，而在0.01水平上，各個(gè)因素的處理間差異不顯著.

表5 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)正交試驗(yàn)極差分析Table5 Variance analysis of cell suspension culture orthogonal design

通過對(duì)細(xì)胞懸浮液中細(xì)胞(圖3)的觀察發(fā)現(xiàn)，初代培養(yǎng)的細(xì)胞懸浮液中包括小細(xì)胞團(tuán)、球形細(xì)胞和長型細(xì)胞.一些細(xì)胞團(tuán)是在細(xì)胞脫離愈傷組織團(tuán)塊的基礎(chǔ)上自身分裂產(chǎn)生的(圖4)，細(xì)胞團(tuán)中的細(xì)胞處于有絲分裂的不同時(shí)期.一般這類的細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞個(gè)數(shù)較少，在10個(gè)左右或10個(gè)以下.初代培養(yǎng)球形單細(xì)胞(圖5)的個(gè)數(shù)較少，通常是以2～3個(gè)細(xì)胞組成細(xì)胞團(tuán)的形式出現(xiàn).初代培養(yǎng)中，長型細(xì)胞以及部分的畸形細(xì)胞產(chǎn)生率較高.

圖3 細(xì)胞懸浮液(×100)Fig.3 Cell suspension liquid(×100)

圖4 旺盛分裂的細(xì)胞團(tuán)(×200)Fig.4 Fast division cell cluster(×200)

2.2.2 正交設(shè)計(jì)培養(yǎng)基中細(xì)胞生長曲線 由圖6可以看出，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長曲線呈現(xiàn)拋物線型，2～4 d生長緩慢，4～6 d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，6 d以后呈現(xiàn)極速下降的趨勢(shì).原因主要是由于后期培養(yǎng)基中養(yǎng)分的消耗和pH值的變化使得懸浮細(xì)胞的生長環(huán)境急劇惡化，導(dǎo)致其分裂速度大幅下降，細(xì)胞死亡.因此，太行菊細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的繼代周期為6～7 d.

圖6 不同培養(yǎng)基上太行菊懸浮細(xì)胞生長曲線Fig.6 The growth curve of Opisthopappus taihangensis suspension cells in different mediums

3 討論

細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的建立多來源于胚性愈傷組織，但是胚性愈傷組織的界定沒有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，不同種植物的胚性愈傷組織也存在一定的差異.通常對(duì)于進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)所采用的愈傷組織不同研究者都有自己的劃分方式，紅景天［5］、草地早熟禾［17］、薰衣草［9］等幾種植物材料的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系建立，對(duì)于不同種類的愈傷組織有自己的劃分.也有研究者籠統(tǒng)地將其描述為生長旺盛、疏松易于分散的愈傷組織，益母草［14］、桑樹［15］、杜仲［16］等植物的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系建立中是采取這種描述的.而對(duì)于太行菊，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合了上述2種方式，從外觀以及解剖觸感等方面以軟硬程度為劃分標(biāo)準(zhǔn)，人為將其劃分為5個(gè)梯度，以2和3為較適合進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的愈傷組織［11］.

圖5 球型單細(xì)胞(×400)Fig.5 Spherical cell(×400)

太行菊的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系初代培養(yǎng)中細(xì)胞的幾種形態(tài)，與報(bào)道的其他種類植物相似［17］，有細(xì)胞團(tuán)、球形細(xì)胞及長形細(xì)胞.而懸浮細(xì)胞的生長曲線與報(bào)道的小菊懸浮細(xì)胞半拋物線生長曲線有所不同［18］，而與紅景天［5］、豐花月季［19］的類似，懸浮細(xì)胞的生長曲線有明顯的峰值，經(jīng)過對(duì)數(shù)生長期后較明顯的下降，這樣的結(jié)果可能是由于培養(yǎng)體系較小，培養(yǎng)液的緩沖能力差，造成培養(yǎng)液環(huán)境過酸不適合細(xì)胞的生長，也有可能是太行菊懸浮細(xì)胞對(duì)于酸性的環(huán)境耐受度較差造成的.

綜上所述，以太行菊為試驗(yàn)材料初步建立了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系:以試管苗莖段為外植體，在MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+2，4-D 1.0 mg·L-1培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的愈傷組織生長迅速，且排列緊密質(zhì)地松軟適合進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng).將獲得的愈傷組織在液體培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0 mg·L-1+2，4-D 0.5 mg·L-1中震蕩培養(yǎng)，建立細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系.

［1］ ROBERTO M，EMANUELA V，CHIARA R，et al.Nitric oxide is involved in cadmium-induced programmed cell death in Arabidopsis suspension cultures［J］.Plant Physiology，2009，150:217-228.

［2］ 李曉蕙，陳 蕾.植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，12(5):74-75.

［3］ 胡海英，趙亞美，閻曉磊，等.香花槐愈傷組織的誘導(dǎo)與細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)［J］.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，29(5):26-30.

［4］ 翟曉巧，胡文遠(yuǎn)，范國強(qiáng).毛泡桐懸浮細(xì)胞培養(yǎng)及其植株再生［J］.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，44(1):34-40.

［5］ 丁 婷，馬 慶，項(xiàng) 艷.紅景天愈傷組織的誘導(dǎo)及細(xì)胞懸浮培養(yǎng)［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，24(5):224-227.

［6］ 胡張華，陳火慶，吳關(guān)庭，等.高羊茅懸浮細(xì)胞系的建立及綠色植株的高頻再生［J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，2003，12(3):95-99.

［7］ 李宗艷.石竹細(xì)胞懸浮培養(yǎng)研究［J］.廣西植物，2004，24(3):266-269.

［8］ 朱根發(fā)，呂復(fù)兵，陳明莉，等.一品紅體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生［J］.亞熱帶植物科學(xué)，2004，33(4):37-38.

［9］ 許耀祖，王曉軍，趙民安，等.薰衣草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的優(yōu)化［J］.細(xì)胞生物學(xué)雜志，2005，27(6):701-704.

［10］鄭啟發(fā)，胡桂兵，陳大成，等.荔枝龍眼細(xì)胞懸浮培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因研究［J］.果樹學(xué)報(bào)，2005，22(2):125-128.

［11］陳發(fā)棣，蔣甲福，郭維明.小菊懸浮細(xì)胞輻射育種初步研究I.基因型外植體和誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基的選擇［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，26(4):26-29.

［12］胡 梟，趙惠恩.太行菊屬與菊屬亞菊屬遠(yuǎn)緣雜交試驗(yàn)初報(bào)［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，15(6):13-14.

［13］ANNADANA S，RADEMAKER W，RAMAMMA M，et al.Response of stem explants to screening and explant source as a basis for methodical advancing of regeneration protocols for chrysanthemum［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2000，62(1):47-55.

［14］李學(xué)棟，龔真才，馬 勇，等.不同培養(yǎng)條件對(duì)益母草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長的影響［J］.西華師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2008，29(2):136-140.

［15］李 勇，邢 輝，張金芳.桑樹懸浮細(xì)胞生長規(guī)律及其生理特性的研究［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2007，33(1):91-94.

［16］王亞琴，葉青華，朱 媛.杜仲細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)綠原酸的初步研究［J］.廣西植物，2008，28(5):671-674.

［17］方文娟，韓烈保，張振環(huán)，等.草地早熟禾懸浮體系的建立及懸浮過程中細(xì)胞形態(tài)觀察［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2006(2):85-87.

［18］陳發(fā)棣，蔣甲福，郭維明，等.小菊懸浮細(xì)胞培養(yǎng)與植株再生研究［J］.園藝學(xué)報(bào)，2006，33(5):1021-1026.

［19］王艷紅，龔束芳，車代弟.豐花月季愈傷組織的誘導(dǎo)及細(xì)胞懸浮培養(yǎng)［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，38(2):161-165.