蔡小東,駱 浩 (長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院,湖北荊州434025)

柑橘是我國(guó)南方重要的主栽果樹之一,通過(guò)生物技術(shù)進(jìn)行柑橘的遺傳改良是一個(gè)切實(shí)可行的方法[1]。體細(xì)胞胚狀體 (體胚)發(fā)生是植物體細(xì)胞離體培養(yǎng)的重要途徑之一。許多植物器官、愈傷組織及原生質(zhì)體等培養(yǎng)過(guò)程中,體胚能否再生關(guān)系到完整植株再生的成敗[2-3]?，F(xiàn)代生物技術(shù)育種已被廣泛應(yīng)用于作物遺傳及品質(zhì)改良,如轉(zhuǎn)基因技術(shù)、體細(xì)胞融合技術(shù)等一般都需要通過(guò)體胚再生途徑獲得完整植株[4-5]。本研究以 ‘國(guó)慶1號(hào)'溫州蜜柑 (Citrus unshiu Marc.cv.Guoqing No.1)成熟果實(shí)中未發(fā)育胚珠為外植體,研究不同種類的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì) ‘國(guó)慶1號(hào)'植株再生的影響,以期為直接以未發(fā)育胚珠為起始材料進(jìn)行柑橘生物技術(shù)育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為 ‘國(guó)慶1號(hào)'溫州蜜柑 (Citrus unshiu Marc.cv.Guoqing No.1)成熟果實(shí)。在超凈工作臺(tái)上將果實(shí)浸泡在75%酒精中約10min后,用鑷子取出并用酒精燈外焰灼燒30～60s。接著將果實(shí)放入已滅菌的培養(yǎng)皿 (內(nèi)放有多張濾紙)中剝開果皮,去掉果肉后可發(fā)現(xiàn)囊衣內(nèi)緊靠中柱處有許多長(zhǎng)約1～2mm未發(fā)育胚珠,用尖嘴鑷子將這些未發(fā)育胚珠輕輕挑下備用。

1.2 胚狀體誘導(dǎo)

將上述未發(fā)育胚珠分別接種于下述培養(yǎng)基A(MT+500mg·L-1麥芽浸出物 (ME))、B(MT+1.0mg·L-1GA3+500mg·L-1ME)、C(MT+2.0mg·L-1BA+0.5mg·L-1IAA)和D(MT+1.0mg·L-1KT+500mg·L-1ME)上。

所有培養(yǎng)基均添加30g·L-1蔗糖及7.5g·L-1瓊脂,pH5.8,暗培養(yǎng)。每種處理接種5瓶,每瓶放置3～5個(gè)胚狀體。

1.3 胚狀體誘導(dǎo)生芽

將獲得的胚狀體接種到培養(yǎng)基E(M T+2.0mg·L-1BA+0.5mg·L-1IAA)上。接種5瓶,每瓶接種5個(gè)胚狀體,培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)出芽的時(shí)間、快慢、質(zhì)量及數(shù)量等。

1.4 再生芽誘導(dǎo)生根

將再生芽切下,置于誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基上 F(MT+0.5mg·L-1NAA+0.1mg·L-1IBA+0.5g·L-1活性碳+20g·L-1蔗糖+7.2g·L-1瓊脂)和G(1/2MT+0.5mg·L-1NAA+0.1mg·L-1IBA+0.5g·L-1活性碳+20g·L-1蔗糖+7.2g·L-1瓊脂)上。每種處理接種5瓶,每瓶接種3個(gè)芽,比較再生根的時(shí)間及根的質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

表1 ‘國(guó)慶1號(hào)'成熟果實(shí)中未發(fā)育胚珠在不同培養(yǎng)基上胚狀體的誘導(dǎo)率

2.1 未發(fā)育胚珠的胚狀體誘導(dǎo)

將 ‘國(guó)慶1號(hào)'溫州蜜柑成熟果實(shí)中未發(fā)育胚珠接種于A～D 4種培養(yǎng)基中,結(jié)果表明,在暗培養(yǎng)60d后,4種供試培養(yǎng)基都能誘導(dǎo)胚狀體的再生,誘導(dǎo)率如表1所示。柑橘體細(xì)胞胚狀體的發(fā)育過(guò)程一般與合子胚一樣,具有經(jīng)過(guò)原胚、心形胚、魚雷形胚及至具子葉的成熟胚的發(fā)育程序。在培養(yǎng)基A和C中既有球形胚狀體的產(chǎn)生,也出現(xiàn)了子葉形胚狀體。在這4種培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基A中胚狀體的誘導(dǎo)率為24.64%,培養(yǎng)基D中胚狀體誘導(dǎo)率高達(dá)28%。此外,在誘導(dǎo)胚狀體的過(guò)程中,未發(fā)現(xiàn)有胚性愈傷組織的出現(xiàn)。這些胚狀體繼續(xù)在原培養(yǎng)基上培養(yǎng)30d后,有次生胚狀體發(fā)生,大部分表現(xiàn)畸形 (圖1(a)和 (b))。圖1(a)所示為培養(yǎng)基A中再生的胚狀體,且再生了次生胚狀體,由于暗培養(yǎng)呈淡黃色同時(shí)還伴有白色子葉型胚狀體。

2.2 胚狀體誘導(dǎo)生芽

胚狀體在生芽培養(yǎng)基上培養(yǎng)15d后,如圖1(c)所示,胚狀體開始膨大變綠,有次生胚狀體的產(chǎn)生,培養(yǎng)30d后胚狀體體積明顯增大。少數(shù)胚狀體萌發(fā)形狀不規(guī)則的小芽。通過(guò)45d的光照培養(yǎng),胚狀體再生了不定芽 (圖1(d))。不定芽的葉片不規(guī)則,個(gè)別部位有黃化現(xiàn)象。生長(zhǎng)出來(lái)的芽后期生長(zhǎng)速度加快,形成植株的莖葉形態(tài)。

2.3 再生芽誘導(dǎo)生根

挑選部分較為健壯的芽進(jìn)行根的誘導(dǎo),以獲得 ‘國(guó)慶1號(hào)'的完整植株。在培養(yǎng)30d后培養(yǎng)基J的生根數(shù)量明顯多于培養(yǎng)基K,K培養(yǎng)基同樣也能夠使再生芽誘導(dǎo)生成不定根,但是較培養(yǎng)基J的根細(xì),側(cè)根較少 (表2)。培養(yǎng)基J中不定芽葉片大且綠,培養(yǎng)基 K的葉片生長(zhǎng)勢(shì)葉片較黃(圖1(e)和 (f))。由此可見,J培養(yǎng)基更加有利于根的誘導(dǎo)。

表2 ‘國(guó)慶1號(hào)'溫州蜜柑胚狀體誘導(dǎo)生根

3 討論

一般而言,柑橘成熟果實(shí)中未發(fā)育胚珠經(jīng)誘導(dǎo)能產(chǎn)生大量的胚性愈傷組織[3,6-8]。本研究以 ‘國(guó)慶1號(hào)'溫州蜜柑成熟果實(shí)中未發(fā)育胚珠為外植體,研究了不同種類的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì) ‘國(guó)慶1號(hào)'植株再生的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)很難獲得愈傷組織,即使再生了愈傷組織也極易玻璃化。以成熟果實(shí)未發(fā)育胚珠為外植體,直接進(jìn)行植株再生,具有操作簡(jiǎn)單易行、容易再生植株等優(yōu)點(diǎn)。并且愈傷組織的遺傳生理功能可能具有胚性,或是喪失胚性,具有胚性的愈傷組織才具有較強(qiáng)的再分化能力,可以再生植株,是各種生物技術(shù)操作的理想材料。此外,愈傷組織隨著繼代次數(shù)的增加和保存時(shí)間的延長(zhǎng),其胚胎發(fā)生能力會(huì)下降,并且存在變異[9-12]。外植體脫分化為愈傷組織,抑或再分化為體細(xì)胞胚胎,終歸是在各種因素的誘導(dǎo)下基因時(shí)空差異表達(dá)的結(jié)果。深入研究離體培養(yǎng)下植物細(xì)胞脫分化及再分化的分子機(jī)制,將為促進(jìn)利用生物技術(shù)創(chuàng)造新新種質(zhì)和遺傳改良奠定基礎(chǔ),具有重要意義。

圖1 ‘國(guó)慶1號(hào)'未發(fā)育胚珠再生植株

[1]Cai X D,Fu J,Deng X X,et al.Production and molecular characterization of potential seedless cybrid plants between pollen sterile Satsuma mandarin and two seedy Citrus cultivars[J].Plant Cell Tiss Org Cult,2007,90:275-283.

[2]von Arnold S,Sabala I,Bozhkov P,et al.Developmental pathways of somatic embryogenesis[J].Plant Cell Tiss O rg Cult,2002,69:233-249.

[3]蔡小東,廖 偉.冰糖橙胚狀體、胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版)農(nóng)學(xué)卷,2010,7(1):56-59.

[4]Grosser J W,Ollitrault P,Olivares-Fuster O.Somatic hybridization in Citrus:An effective tool to facilitate variety improvement[J].In vitro Cell Dev Biol-Plant,2000,36:434-449.

[5]Cai X D,Fu J,Chen C L,et al.Cybrid/hybrid plants regenerated from somatic fusions between male sterile Satsuma mandarin and seedy tangelos[J].Sci Hortic,2009,122:323-327.

[6]霍合強(qiáng),鄧秀新.寬皮柑橘品種的胚性愈傷組織誘導(dǎo)[J].實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào),1999,32(3):289-295.

[7]范永梅,甘 霖,鄧秀新.冰糖橙胚性愈傷組織的誘導(dǎo)與植株再生[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,22(4):399-402.

[8]張秀枝.紅江橙與檸檬愈傷組織誘導(dǎo)的研究 [J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,39(1):6-11.

[9]霍合強(qiáng),鄧秀新.柑桔胚性愈傷組織的誘導(dǎo)、保存和利用 [J].植物生理學(xué)通訊,2000,36(2)181-187.

[10]張俊娥,鄧秀新.柑橘愈傷組織植株再生及其倍性鑒定[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,26(2):237-238.

[11]Bao Y,Dharmawardhana P,Mockler T,et al.Genome scale transcriptome analysis of shoot organogenesis in Populus[J].BMC Plant Biol,2009,9:132.

[12]Che P,Lall S,Nettleton D,et al.Gene expression programs during shoot,root,and callus development in Arabidopsis tissue culture[J].Plant Physiol,2006,141:620-637.