樊玉文，張園，趙衛(wèi)平，虞同華，劉方舟

(江蘇省腫瘤醫(yī)院頭頸外科，江蘇南京 210009)

甲狀腺腫瘤是臨床最常見(jiàn)的頭頸腫瘤之一，診療技術(shù)的進(jìn)步使得臨床甲狀腺腫塊檢出明顯增多。大多數(shù)的甲狀腺腫瘤單靠病理形態(tài)學(xué)特征可以診斷，但在臨床病理診斷中對(duì)甲狀腺濾泡樣病變?nèi)鐬V泡性腺瘤、濾泡性癌、濾泡型乳頭狀癌及乳頭狀癌與乳頭狀增生結(jié)節(jié)間的鑒別有時(shí)仍較為困難。診斷這些特殊類型的腫瘤，免疫組化方法比較有幫助。對(duì)甲狀腺乳頭狀癌病人，研究鑒別診斷和預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的輔助診斷指標(biāo)有現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)研究甲狀腺良惡性病變組織中之β-半乳糖凝集素-3(galectin-3)和上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達(dá)，以期提高甲狀腺腫瘤病理診斷的準(zhǔn)確性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究資料來(lái)自江蘇省腫瘤醫(yī)院頭頸外科及江蘇省人民醫(yī)院病理科1996年1月至2005年12月手術(shù)切除標(biāo)本。其中甲狀腺乳頭狀癌236例，患者男36例，女200例;年齡12～82歲，中位年齡48歲，≥45歲54例，＜45歲182例;腫瘤直徑≥2 cm者126例，＜2 cm者110例。另有結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴乳頭狀增生10例，甲狀腺腺瘤10例。上述資料按病變不同分3組進(jìn)行比較研究。全部標(biāo)本常規(guī)10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋，應(yīng)用組織芯片制作器械制作12×15點(diǎn)陣芯片蠟塊。所有病理結(jié)果均經(jīng)病理科兩位副主任醫(yī)師證實(shí)。患者術(shù)前均未接受其他相關(guān)治療，并均具有完整臨床及隨訪資料。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本準(zhǔn)備 采用免疫組化SP法，各組標(biāo)本常規(guī)石蠟切片，高溫修復(fù)抗原，DAB顯色。

1.2.2 對(duì)照實(shí)驗(yàn) 分別用已知陽(yáng)性切片作免疫組化陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作免疫組化陰性對(duì)照。

1.2.3 結(jié)果判斷 免疫組化陽(yáng)性表達(dá)的判斷按照以下判斷標(biāo)準(zhǔn):選染色均勻的腫瘤區(qū)，在400倍視野下計(jì)數(shù)著色細(xì)胞占視野細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù)，共計(jì)數(shù)5個(gè)視野，取平均值，以著色細(xì)胞占視野細(xì)胞總數(shù)的多少分0～3級(jí)，0為0級(jí)，＜25%為1級(jí)，25% ～50%為2級(jí)，＞50%為3級(jí)。本試驗(yàn)中0、1級(jí)為陰性(－)，2、3級(jí)為陽(yáng)性(+)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用卡方檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)和Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)，應(yīng)用 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包在計(jì)算機(jī)上完成。

2 結(jié) 果

2.1 β-半乳糖凝集素-3蛋白表達(dá)情況

β-半乳糖凝集素-3在3組病變組織中的表達(dá)情況見(jiàn)表1。β-半乳糖凝集素-3表達(dá)于陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色著色(圖1)。β-半乳糖凝集素-3表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理間的關(guān)系見(jiàn)表2。

表1 β-半乳糖凝集素-3在3組病變組織中的表達(dá)

圖1 甲狀腺乳頭狀癌組織芯片切片照片 β-半乳糖凝集素-3免疫組化染色×20

表2 甲狀腺乳頭狀癌β-半乳糖凝集素-3表達(dá)與臨床病理間的關(guān)系

2.2 上皮鈣黏蛋白表達(dá)情況

上皮鈣黏蛋白在3組病變組織中的表達(dá)情況見(jiàn)表3。上皮鈣黏蛋白表達(dá)于陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒及彌漫性著色，有極少細(xì)胞核著色(圖2)。上皮鈣黏蛋白表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理間的關(guān)系見(jiàn)表4。

表3 上皮鈣黏蛋白在3組病變組織中的表達(dá)

圖2 甲狀腺乳頭狀癌組織芯片切片照片 上皮鈣黏蛋白免疫組化染色×20

表4 甲狀腺乳頭狀癌上皮鈣黏蛋白表達(dá)與臨床病理間的關(guān)系

3 討 論

在病理診斷及臨床工作中，病理切片顯示明顯增生的甲狀腺乳頭相對(duì)比較常見(jiàn)。當(dāng)鏡下切片中有濾泡的非典型性改變及甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞核的個(gè)別病理特征時(shí)，診斷結(jié)論難以確立，特別易將甲狀腺乳頭狀增生診斷為甲狀腺乳頭狀癌。這些病理診斷在甲狀腺術(shù)中快速病理切片及術(shù)前細(xì)針穿刺涂片時(shí)更容易發(fā)生。近來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究?jī)A向依靠免疫組化方法輔助診斷甲狀腺乳頭狀癌。我們對(duì)甲狀腺良惡性疾病中β-半乳糖凝集素-3與上皮鈣黏蛋白的表達(dá)進(jìn)行了對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)了兩蛋白的表達(dá)與腫瘤臨床病理之間的相關(guān)性。

β-半乳糖凝集素-3屬凝蛋白集素(galectin)家族成員[1]，是一種糖類結(jié)合蛋白，分子質(zhì)量約 31 ku，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，在活動(dòng)的巨噬細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、上皮細(xì)胞(如甲狀腺、胃、腸)及一些感覺(jué)神經(jīng)元中表達(dá)最多。它包括一個(gè)可與羧基端相互作用的-NH2末端、一個(gè)為基質(zhì)金屬蛋白酶的底物和COOH-末端區(qū)[2]。以往的研究認(rèn)為，正常甲狀腺及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、腺瘤等良性病變不表達(dá) β-半乳糖凝集素-3[3]，而甲狀腺乳頭狀癌幾乎所有病例均為β-半乳糖凝集素-3陽(yáng)性，在濾泡性癌的表達(dá)各種報(bào)道不統(tǒng)一[4]。也有人認(rèn)為β-半乳糖凝集素-3是濾泡性癌尤其是微小浸潤(rùn)性癌的一個(gè)標(biāo)記[5]。我們發(fā)現(xiàn)，β-半乳糖凝集素-3在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、甲狀腺腺瘤及甲狀腺乳頭狀癌中分別表達(dá)為 30.0% 、20.0%、95.8%(見(jiàn)表 1)，說(shuō)明 β-半乳糖凝集素-3的表達(dá)情況對(duì)甲狀腺乳頭狀癌與良性疾病鑒別診斷有較好的指導(dǎo)意義。

近年來(lái)，β-半乳糖凝集素-3與甲狀腺癌的相互關(guān)系也是研究的熱點(diǎn)，新近的研究結(jié)果顯示該蛋白同腫瘤凋亡相關(guān)[6-7]。本研究結(jié)果顯示，β-半乳糖凝集素-3在甲狀腺腺瘤和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴乳頭狀增生中的陽(yáng)性表達(dá)率僅為20.0%和30.0%，且大部分是弱陽(yáng)性表達(dá)。在其中2例甲狀腺腺瘤陽(yáng)性病例中，有1例甲狀腺腺泡上皮增生相對(duì)活躍，病理形態(tài)上雖然沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該病例有腫瘤包膜或臨近血管浸潤(rùn)等病理惡性證據(jù)，但陽(yáng)性病灶在不典型腺瘤內(nèi)及上皮增生活躍的局部有表達(dá)，是否β-半乳糖凝集素-3蛋白的表達(dá)預(yù)示了這些病變的潛在惡性，有待我們進(jìn)一步研究證實(shí)。

甲狀腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與β-半乳糖凝集素-3表達(dá)間的關(guān)系現(xiàn)有研究結(jié)論并不一致。Kawachi等[8]研究發(fā)現(xiàn)，β-半乳糖凝集素-3表達(dá)水平在甲狀腺乳頭狀癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，并且對(duì)原發(fā)及轉(zhuǎn)移病灶石蠟包埋標(biāo)本進(jìn)行分析顯示，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)表達(dá)β-半乳糖凝集素-3明顯低于原發(fā)腫瘤，推測(cè)β-半乳糖凝集素-3在甲狀腺腫瘤發(fā)展的不同時(shí)期起不同的作用。另外，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)β-半乳糖凝集素-3的表達(dá)與甲狀腺癌是否轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)[9]。我們的研究結(jié)果顯示，β-半乳糖凝集素-3在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組原發(fā)灶的陽(yáng)性表達(dá)較無(wú)淋巴結(jié)組高，有顯著性差異(P＜0.05)，提示β-半乳糖凝集素-3的表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯相關(guān)性。我們的研究可以提高術(shù)前針吸細(xì)胞學(xué)診斷的準(zhǔn)確率，對(duì)常規(guī)診斷難以鑒別的甲狀腺良、惡性腫瘤具有重要的鑒別診斷價(jià)值。然而β-半乳糖凝集素-3在有和無(wú)包膜外侵犯的甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05，表2)，顯示β-半乳糖凝集素-3對(duì)有無(wú)包膜外侵犯病例無(wú)鑒別意義。β-半乳糖凝集素-3表達(dá)水平的高低與腫瘤的浸潤(rùn)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。

鈣黏蛋白是一組Ca2+依賴性跨膜糖蛋白，目前的研究認(rèn)為上皮鈣黏蛋白與腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的關(guān)系較密切。該蛋白存在于上皮細(xì)胞中的鈣依賴性跨膜糖蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間互相黏附，對(duì)組織發(fā)生及維持上皮細(xì)胞的極性、形態(tài)起著重要作用[10]。在正常細(xì)胞間，上皮鈣黏蛋白表達(dá)穩(wěn)定，而在癌細(xì)胞間，其表達(dá)常降低或缺失。該蛋白近年來(lái)已成為研究多種腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的熱點(diǎn)之一[11]。

上皮鈣黏蛋白在人體多種上皮來(lái)源的腫瘤中均有異常表達(dá)，如乳腺小葉癌、彌漫型胃癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、肝癌、食管癌、皮膚癌、腎癌和肺癌等;最近還報(bào)道在胃癌、卵巢癌、宮頸癌中有上皮鈣黏蛋白基因的突變和等位基因的雜合性缺失[12-14]。上皮鈣黏蛋白的表達(dá)降低，導(dǎo)致細(xì)胞間黏附作用下降和極性的紊亂，喪失接觸抑制而出現(xiàn)細(xì)胞的無(wú)限制增殖失分化，細(xì)胞連接松散，易于從局部脫落得到較強(qiáng)的浸潤(rùn)能力，極易擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移[15]。

目前認(rèn)為上皮鈣黏蛋白免疫組化強(qiáng)度與原發(fā)瘤臨床分期呈負(fù)相關(guān)，上皮鈣黏蛋白mRNA表達(dá)減少或缺失易發(fā)生局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。上皮鈣黏蛋白功能失調(diào)導(dǎo)致癌細(xì)胞脫離原發(fā)灶可能是腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移關(guān)鍵的始動(dòng)環(huán)節(jié)[16]。Brabant等[17]發(fā)現(xiàn)，上皮鈣黏蛋白的表達(dá)受一定濃度范圍TSH的影響，TSH濃度的增加可誘導(dǎo)甲狀腺細(xì)胞中上皮鈣黏蛋白mRNA和蛋白的表達(dá)，其結(jié)論顯示上皮鈣黏蛋白的表達(dá)受TSH-cAMP依賴路徑的控制，推測(cè)上皮鈣黏蛋白的上調(diào)表達(dá)可能在甲狀腺癌中扮演了重要的角色。另有研究[18]顯示，上皮鈣黏蛋白表達(dá)缺失的分化型甲狀腺癌患者術(shù)后生存率低于上皮鈣黏蛋白陽(yáng)性表達(dá)的患者，且上皮鈣黏蛋白的免疫組化染色是分化型甲狀腺癌的一個(gè)預(yù)后指標(biāo)。我們研究的結(jié)果顯示:上皮鈣黏蛋白在腺瘤及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴乳頭狀增生組織中絕大部分為陽(yáng)性表達(dá)，個(gè)別病例陽(yáng)性表達(dá)較強(qiáng)，乳頭狀癌病例幾乎均為中低度和陰性表達(dá)。甲狀腺腺瘤組和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴乳頭狀增生組分別與乳頭狀癌組比較均存在顯著性差異(P＜0.05，表3)。上皮鈣黏蛋白在有腺體外侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例表達(dá)低于無(wú)腺體外侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例(P＜0.05，表 4)。

組織芯片技術(shù)是最近新興的一種免疫組化技術(shù)，實(shí)驗(yàn)時(shí)可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)組織標(biāo)本，于同一條件下得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以盡可能地減少多次實(shí)驗(yàn)帶來(lái)的誤差，克服了傳統(tǒng)病理學(xué)技術(shù)實(shí)驗(yàn)速度慢和效率低的缺點(diǎn)。我們運(yùn)用這一原位組織學(xué)方法研究了β-半乳糖凝集素-3及上皮鈣黏蛋白兩種蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)，節(jié)約了試劑并且提高了效率。

本實(shí)驗(yàn)顯示β-半乳糖凝集素-3、上皮鈣黏蛋白免疫組化檢測(cè)能鑒別良、惡性甲狀腺結(jié)節(jié)，并可判斷腫瘤是否包膜侵犯及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，對(duì)甲狀腺腫瘤患者的臨床診斷和指導(dǎo)治療具有重要的臨床價(jià)值。另外，本組資料顯示，甲狀腺乳頭狀癌組織β-半乳糖凝集素-3陽(yáng)性率很高，而上皮鈣黏蛋白陽(yáng)性率偏低，提示β-半乳糖凝集素-3和上皮鈣黏蛋白兩種蛋白的表達(dá)可能共同影響著腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，我們將在以后的實(shí)驗(yàn)中對(duì)兩種蛋白的具體作用進(jìn)行更加深入的研究。

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