劉晶，馬坤嶺，倪杰，黃文瑾，劉必成，陳壓西，阮雄中

(1.東南大學附屬中大醫(yī)院腎內(nèi)科，江蘇 南京 210009;2.重慶醫(yī)科大學教育部感染性疾病分子生物學重點實驗室脂質(zhì)研究中心，重慶 400016)

血管平滑肌細胞(VSMC)是血管中膜的主要細胞，其舒縮調(diào)節(jié)著血流和血壓，病理情況下VSMC參與動脈粥樣硬化、血管再狹窄等的發(fā)生、發(fā)展[1]。體外培養(yǎng)原代VSMC是近年來一些實驗室常用的技術，成為平滑肌細胞功能研究的前提。之前的研究多是從大鼠、兔等動物中分離VSMC。近年來，盡管小鼠作為模式生物在生物醫(yī)學研究中的優(yōu)勢越來越明顯，但分離小鼠原代主動脈平滑肌細胞的報道不多[2]。采用酶消化法獲得的原代細胞所需時間短、耗材少，但消化酶受溫度和時間的影響大，不如傳統(tǒng)的組織貼塊法培養(yǎng)穩(wěn)定。本實驗采用組織貼塊法成功培養(yǎng)了動脈粥樣硬化模型小鼠主動脈VSMC，并對其進行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物來源 載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠，遺傳背景為C57BL/6小鼠，是經(jīng)典的動脈粥樣硬化模型小鼠，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，鼠齡8周以上。

1.1.2 主要試劑及配制 水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司)，磷酸鹽平衡液(PBS，武漢博士德公司)，DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司)，青鏈霉素(Hyclone公司)，谷氨酰胺(Sigma公司)，胎牛血清(FBS，Gibco公司)，重組胎牛成纖維細胞生長因子(R＆D公司)，0.25% 胰酶(Hyclone公司)，肌動蛋白(α-SMA，Abcam公司)，免疫組化試劑盒、DAB染色試劑盒(福州邁新公司)，Alex488羊抗兔二抗(Invitrogen公司)，100%乙醇(上海久億化學試劑有限公司)。

75%乙醇:取75 ml乙醇至量筒中，加蒸餾水至100 ml。10%水合氯醛:10 g水合氯醛溶于100 ml蒸餾水中，置37℃水浴鍋中至完全溶解。20%FBS DMEM/F12培養(yǎng)基:160 ml DMEM/F12中加入40 ml FBS;加100 μl青、鏈霉素至終濃度分別為 100 U·ml－1和 100 μg·ml－1;加2 mlL-谷氨酰胺至終濃度 2 mmol·L－1;加 8 μl成纖維細胞生長因子至終濃度1 ng·ml－1。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代細胞培養(yǎng) 10%水合氯醛2 ml腹腔注射麻醉小鼠，浸泡在75%乙醇中。在無菌條件下打開胸、腹腔，暴露心臟;1 ml注射器穿刺右心室，抽出循環(huán)中血液，10 ml注射器抽取無菌PBS約8 ml，連接在穿刺左心室的頭皮針上，沖洗主動脈;依次剪去胸腹腔器官直至暴露主動脈，完整分離主動脈，放入35 mm無菌平皿中，加入1 ml無菌PBS(pH 7.2)，迅速轉移至超凈臺。用鑷子小心剝離主動脈外的脂肪組織，至血管光滑透明，PBS緩沖液中漂洗2次。將剝離的血管轉入另一個裝有3 ml含20%FBS DMEM/F12培養(yǎng)液的35 mm無菌平皿中，用眼科剪剪碎，碎片大小1 mm×1 mm左右。將組織塊均勻種植于培養(yǎng)瓶底，翻轉培養(yǎng)瓶，加入2 ml含20%FBS的新鮮DMEM/F12培養(yǎng)基;6 h后待組織塊牢固貼附于細胞瓶底，再輕輕翻轉培養(yǎng)瓶，使組織塊完全浸沒于培養(yǎng)液中。放入含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱，靜止培養(yǎng)3 d，觀察后換液。

1.2.2 細胞的生長和傳代 細胞接種3 d后，貼壁的細胞呈放射性伸展，部分區(qū)域已融合生長，立即更換新鮮培養(yǎng)基，棄去沒有貼壁的細胞及破碎細胞。當單層細胞鋪滿近培養(yǎng)瓶底的80%以上時即可進行傳代。傳代時，棄去舊的培養(yǎng)液，加PBS緩沖液并翻轉清洗細胞面，重復3次;加入適量的0.25%胰酶，放入培養(yǎng)箱中消化2～3 min;當顯微鏡下觀察到細胞成片地收縮變圓時，立即加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，將細胞自瓶壁上吹打下來，第1次原瓶培養(yǎng)，補足培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱。5 d后可再傳代。

1.3 細胞鑒定

1.3.1 相差顯微鏡檢查 按常規(guī)方法觀察細胞形態(tài)。

1.3.2 α-SMA免疫組化染色 將細胞用胰酶消化、離心，種植在放有載玻片的24孔板中培養(yǎng)。待細胞生長良好，棄培養(yǎng)液，加PBS放于搖床上洗滌3次，每次5 min;棄 PBS，每孔加入 500 μl 4%的多聚甲醛固定30 min;用 PBS洗滌5 min×3次;加入0.25%Triton X-100室溫15 min以便抗體更好地進入細胞;用PBS洗滌5 min×3次;用10%山羊血清37℃封閉非特異性抗體30 min，勿洗;加兔抗鼠 α-SMA一抗(1∶100稀釋)，4℃過夜;PBS洗滌5 min×3次;生物素標記二抗，室溫孵育30 min;PBS洗滌5 min×3次;鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶，室溫孵育20 min;PBS洗滌5 min×3次;DAB顯色劑顯色5～10 min，在顯微鏡下觀察，待細胞著色而背景顏色較淡時馬上吸去顯色液，PBS充分沖洗，蘇木素復染1 min，PBS充分清洗后置于普通光鏡下觀察。

1.3.3 α-SMA免疫熒光染色 將細胞用胰酶消化、離心，種植在放有載玻片的24孔板中培養(yǎng)。待細胞生長良好，棄培養(yǎng)液，加PBS放于搖床上洗滌5 min×3次;棄PBS，每孔加入500 μl 4%的多聚甲醛固定30 min;用 PBS洗滌5 min×3次;加入 0.25%Triton X-100室溫15 min以便抗體更好地進入細胞;用PBS洗滌5 min×3次;加入10%山羊血清37℃封閉非特異性抗體60 min;繼而加入兔抗鼠 α-SMA一抗(1∶100稀釋)，4℃過夜;PBS洗滌5 min×3次;熒光標記羊抗兔二抗(1∶1 000稀釋)37℃避光孵育2 h;PBS洗滌5 min×3次;加入 DAPI染核，室溫避光10 min;PBS洗滌5 min 1次;然后用10%的甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察。

2 結 果

細胞接種3 d后可見培養(yǎng)瓶底少數(shù)細胞自組織塊周圍游離出來;5 d后細胞生長迅速，呈典型的峰谷樣生長，細胞形體多呈長梭形、核大，可見明顯的肌絲纖維(圖 1)。免疫組化結果顯示，超過98%的 VSMCs α-SMA表達呈陽性，即細胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色反應，胞核呈紫色(圖2);免疫熒光結果亦顯示，超過98%的VSMCs α-SMA表達呈陽性，即細胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)綠色，胞核呈藍色(圖3)。

3 討 論

動脈VSMC是動脈中膜的主要細胞成分，高血壓、動脈粥樣硬化、肺動脈高壓等心血管系統(tǒng)疾病均以VSMC的異常增生和遷移為特征，因此建立簡單高效、切實可行的原代VSMC分離培養(yǎng)方法，是研究VSMC在各種因素作用下生物學特性必不可少的環(huán)節(jié)[3]。

圖1 分離培養(yǎng)的原代主動脈平滑肌細胞 ×200Fig 1 Morphology of primary cultured artery VSMCs(×200)

圖2 α-SMA免疫組化染色 ×400Fig 2 Immunohistochemistry staining of α-SMA expression in VSMCs(×400)

一直以來，原代平滑肌細胞培養(yǎng)都采用組織貼塊培養(yǎng)法和酶消化法，兩者各有所長。酶消化法雖然耗時短，獲得細胞數(shù)目多，但消化酶的選擇則因動物種屬而異，消化的時間、溫度要求較為嚴格，而且一些膠原酶價格昂貴，實驗成本高。組織貼塊法是常用的、簡便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法，可避免酶消化法的上述弊端[4]。

在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)以下幾點與實驗成功率、分離的細胞數(shù)量及純度密切相關:(1)在解剖鏡下撕掉外膜。黑色破布狀外膜要撕干凈，否則會直接影響分離細胞的純度，因為外膜的成纖維細胞生長快且能和VSMC競爭營養(yǎng)，這一步需要細致進行。(2)小鼠主動脈細小壁薄，內(nèi)皮細胞數(shù)量少，內(nèi)膜無須刮除，在傳代2次后基本可以排擠掉。(3)由于小鼠的主動脈組織有限，應選擇瓶底面積為12.5 cm2的培養(yǎng)瓶，否則細胞密度過低會直接影響細胞的生長速度，導致老化，因為VSMC生長過程中分泌的一些細胞因子會促進自身的生長。

圖3 α-SMA免疫熒光染色 ×400Fig 3 Immunofluorescence staining of α-SMA expression in VSMCs(×400)

VSMC 有許多標記分子[1]，如 α-SMA[5-6]、心肌肌凝蛋白多肽(SM-MHC)[6]、平滑肌 22α(SM22α)等，常被用以鑒定原代VSMC的純度和分化狀態(tài)，而α-SMA為鑒定平滑肌細胞的傳統(tǒng)標志物[7-8]。因此我們選擇α-SMA對原代培養(yǎng)VSMC進行鑒定。VSMC并非一種終末分化的細胞，在特定的條件下可以發(fā)生“表型轉換”[1]。體外培養(yǎng)條件下，原代VSMC傳代后分化狀態(tài)是否會改變，可能會直接影響VSMC的體外功能。在應用大鼠的原代VSMC的研究中，應用第3～15代大鼠肺動脈 VSMC[9]或第 11 ～15 代大鼠 VSMC[10]均有報道。而小鼠的VSMC研究中，有采用第3～8代小鼠主動脈VSMC進行研究的報道[5]，也有謹慎的學者在分離主動脈VSMC后僅使用第3～5代進行研究[6]。在本實驗中，我們應用α-SMA的免疫組化和免疫熒光染色鑒定分離培養(yǎng)的第6代VSMC，98%的細胞都表達α-SMA分子，證明其分化狀態(tài)沒有改變，可用于體外研究。

總之，我們采用的VSMC的原代細胞組織貼塊培養(yǎng)法操作簡單，結果穩(wěn)定，純度較高，重復性好，可作為研究和防治心血管疾病的細胞模型。

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