李一生，朱長清

（1.黑龍江省綏化市北林區(qū)畜牧局，黑龍江 綏化 152000；2.北京德佳牧業(yè)科技有限公司，北京 100098）

日本腦炎病毒（JEV）又稱乙型腦炎病毒，由乙型腦炎病毒引起的流行性乙型腦炎簡稱乙腦。乙腦病毒在分類上屬于黃病毒科（Flaviviridae）黃病毒屬（Flavivirus）成員，乙型腦炎病毒基因為單股正鏈RNA，病毒顆粒呈球形，有包膜，直徑40～60 nm，病毒粒子呈20面體對稱。豬是乙腦病毒的中間宿主，帶毒豬是本病的傳染源，臨床上以引起母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，公豬發(fā)生睪丸炎為特征。乙腦是一種人畜共患的自然疫源性疾病，能夠引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，對人類危害巨大，據(jù)統(tǒng)計全球每年平均發(fā)病50 000人，死亡15 000人，尤其在農(nóng)村地區(qū)，死亡率更大。

1 JEV的流行特點

日本腦炎病毒于1870年在日本首先發(fā)現(xiàn)[1]。于1935年從患有乙型腦炎死亡病人、死馬的腦組織和蚊蟲中分離到該病毒，首次確定了乙型腦炎的病原。我國于1949年在北京首次分離得到乙腦病毒，隨后在我國其他地區(qū)也相繼分離到該病毒[2]。乙型腦炎病毒的流行地域很廣，主要流行于遠東及東南亞國家和地區(qū)[3－4]。韓國、泰國、印度尼西亞的爪哇島、臺灣、俄羅斯西伯利亞的濱海地區(qū)等相繼有乙腦的報道，在印度西北和西南的Kerala和Haryana州也有報道乙腦的流行[5－7]。近年澳大利亞本土和美國的關島地區(qū)也出現(xiàn)乙腦病例[8]。表明該病的流行區(qū)域在不斷擴大，成為嚴重的公共衛(wèi)生問題。世界衛(wèi)生組織已把JEV疫苗確定為優(yōu)先研究和開發(fā)的項目之一，如何選擇合適的乙型腦炎疫苗防治JEV感染，是當今人們在該領域研究的熱點問題，近年來我國對JEV進行了大量研究。在JEV活疫苗的研究方面我國居于世界領先水平。余永新等研究成功的JEV活疫苗SA14－14－2株已大量用于人群，這一成果使我國的乙腦發(fā)病率顯著下降[9]。因此深入研究中國流行乙腦病毒的分子生物學，對于了解亞洲乃至全世界的乙腦病毒的特性具有舉足輕重的作用。

2 JEV結構蛋白的特點

目前還沒有治療乙腦的有效藥物，接種乙腦疫苗是控制乙腦的重要措施。國際上廣泛使用的乙腦疫苗主要是滅活苗，我國使用的主要是SA14－14－2株原代地鼠腎細胞減毒活疫苗。這兩種疫苗都存在一些缺點，諸如過敏反應，造價昂貴等，因此研究一種經(jīng)濟、有效、安全的疫苗成為必然趨勢。

E蛋白是乙腦病毒的囊膜蛋白，已經(jīng)證明E蛋白是與細胞膜受體相結合而與細胞膜融合使病毒進入細胞的主要蛋白，與病毒的吸附、侵入、致病性、組織嗜性、血凝反應、血清特異性和誘導宿主的免疫應答等緊密相關。乙腦病毒E基因編碼病毒包膜糖蛋白，糖蛋白的活性區(qū)域由3個Domain、411 個氨基酸殘基組成[10－11]。Kolaskar等學者的研究結果顯示，乙腦病毒包膜蛋白的三維結構主要由三個結構域DomainⅠ、Ⅱ、Ⅲ組成，結構域Ⅰ為E1～E51、E137～E196、E293～E311；結構域 Ⅱ 為 E52～E137、 E197～E292； 結 構 域 Ⅲ 為E310～E411[8]。結構域Ⅲ獨立地在病毒表面折疊成為疫球蛋白樣的結構，由于這種構象，許多抗原中和表位都集中于這一結構域。其中DomainⅢ參與受體結合，是重要的抗原決定簇；DomainⅢE327位點又是決定抗原性的關鍵位點[11]?？乖泻捅砦坏难芯恐饕杏诮Y構域Ⅲ，以往學者對這一區(qū)域的研究顯示，E333、E373～395以及E306、E331和E387都與病毒的中和活性直接相關[12－14]。通過強弱毒株E蛋白氨基酸序列分析，E蛋白上E138、E176、E315、E439位點上氨基酸的突變在病毒減毒過程中起了重要作用[15]。確定JEV毒性的10個關鍵性氨基酸的位置均在E蛋白上，分別位于E107、E135、E138、E176、E177、E232、E244、E264、E279、E315、E439、E447。Wu 等利用噬菌體呈現(xiàn)技術，從肽庫中篩選對病毒單抗高親和力的肽段，確定病毒在結構域Ⅲ中的中和位點主要集中在 E337～E345、E377～E382、E397～ E403這3個區(qū)域內[13]。在這一區(qū)域發(fā)生的變異會導致抗原性的改變，甚至影響抗原與中和抗體的結合反應，而中和抗體在預防乙腦中起主導作用[16]。

3 JEV毒株分類的特點

國際上乙腦病毒的基因分型采用Chen等學者建立的基因分型法，選擇位于PrM區(qū)的乙腦病毒基因組456～695位的240個核苷酸長度序列作為基因分型的基礎[17－18]。由于乙腦病毒在這一該區(qū)段所受進化壓力較小，可以采用該區(qū)段來反映乙腦病毒的自然進化狀況。乙腦病毒以此分為泰國北部及柬埔寨地區(qū)分離的毒株屬于基因Ⅰ型；來自于泰國南部、馬來西亞、印度尼西亞的毒株形成基因Ⅱ型；來自于日本、中國等地區(qū)的毒株屬于基因Ⅲ型；部分印度尼西亞的JKT6468毒株獨自形成了基因IV型[17]。我國病毒學者曾分離出多株乙腦病毒，且研究證實這些毒株間免疫原性存在差異，而以SA14－14－2株為疫苗毒株生產(chǎn)疫苗，應用于JEV的疾病控制起到了一定的保護作用[6]。

乙型腦炎病毒的分類有著明顯的地域性，相同的國家和地區(qū)分離到的毒株的相似性很高[19－21]。日本于1935年分離第一株JEV Nakayama及其后分離JEV都屬于基因Ⅲ型，期間1991年分離株JaOArK36291屬于基因Ⅰ型，從1994年后分離的所有毒株均屬于基因Ⅰ型[22]。韓國報道1991年前所分離的JEV屬于基因Ⅲ型，1994年的分離的2個毒株屬于基因Ⅰ型[23]。我國以往分離的JEV屬于基因Ⅲ型[24]。但是近十多年來，乙腦病毒基因型的地區(qū)有了新的變化，2001年從上海市奉賢縣采集的三帶喙庫蚊中新分離的7株JEV屬于基因Ⅰ型[25]。2002和2007年在遼寧先后分離到基因Ⅰ型乙腦病毒，也是東北地區(qū)首次分離到基因Ⅰ型的乙腦病毒[26－27]。2000年澳大利亞分離的病毒株分別屬基因Ⅰ、Ⅱ型并報道首例乙腦病毒的分子生物學特性[5]。

4 JEV的治病機制及診斷方法

4.1 治病機制

當攜帶乙腦病毒的蚊蟲叮咬動物或人后，病毒隨著蚊蟲唾液進入皮下，先在局部毛細血管壁內皮細胞及淋巴結等處的細胞中增殖，隨后少量病毒進入血流形成短暫的第一次病毒血癥，但僅有少數(shù)感染者發(fā)展成為顯性感染[28－30]。感染后是否發(fā)病起決于入侵病毒的數(shù)量、病毒強度及機體的免疫狀況。當機體抗病能力強時，病毒即被消滅，臨床上也不表現(xiàn)癥狀，成為隱形的病毒攜帶者。當機體的抵抗力低時，病毒可能隨血液散布到肝臟、脾臟等組織細胞中繼續(xù)繁殖，如果被感染者是抵抗力很低的幼兒、老人等，病毒就可通過血腦屏障進入腦組織內增殖，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病變。病毒進入腦內，增殖達到一定數(shù)量時造成腦損傷，表現(xiàn)出病癥。

乙型腦炎的主要預防措施是防蚊、滅蚊和免疫接種。滅蚊是防治乙型腦炎的重要措施，滅蚊的方法主要是藥物法、生物法和生態(tài)學方法，但是徹底滅蚊是不現(xiàn)實的，免疫接種是預防乙型腦炎的最重要最有效的措施。豬是乙型腦炎傳播過程中的重要宿主，乙腦病毒的感染呈現(xiàn)豬→蚊→人的鏈狀結構。我國自1968年對人使用乙腦疫苗接種，明顯地控制了乙型腦炎的流行。目前應用最為廣泛的是鼠腦滅活疫苗，原代地鼠腎滅活疫苗和原代地鼠腎減毒活疫苗。

4.2 診斷方法

4.2.1 臨床診斷

乙型腦炎有嚴格的季節(jié)性，發(fā)生呈散在性，有明顯的腦炎癥狀，懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、過臨產(chǎn)期不生，公豬發(fā)生睪丸炎。死后取大腦皮質、丘腦和海馬角進行組織學檢查，發(fā)現(xiàn)非化膿性腦炎等，可作為診斷的依據(jù)。肉眼病變主要在腦、脊髓、睪丸和子宮。腦膜和腦質充血、出血、水腫。腫脹的睪丸實質充血、出血和壞死灶。流產(chǎn)胎兒常見腦水腫、腹水增多，皮下有血樣浸潤，胎兒大小不等，有的呈木乃伊化[31－32]。

4.2.2 病原學診斷

病毒的分離鑒定是診斷乙腦病毒感染最直接、最傳統(tǒng)的病原學方法。從發(fā)病初期的患者血液、尸體腦組織均可分離到乙腦病毒。分離病毒可用BHK－21、非洲綠猴腎細胞（Vero）等。病毒分離還可以采用乳鼠腦內接種的方法，但敏感性低于細胞分離。在本病流行初期，采取發(fā)熱期血液，立即進行雞胚卵形黃囊接種或1～5日齡乳鼠腦內接種，可分離到病毒，但分離率不高。分離到病毒后可以采用反向被動血凝試驗、免疫細胞化學法、熒光抗體染色法、膠體金免疫層析試紙條法、RT－PCR技術、Real－Time PCR技術和基因芯片技術等方法對其進行進一步確認[33－34]。

4.2.3 血清學診斷方法

血清或腦脊液中乙型腦炎特異性抗體檢測是最常用和有效的診斷方法。特異性抗體的檢測方法包括血凝抑制試驗、補體結合試驗、中和試驗、乳膠凝集試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗、間接免疫熒光試驗等。

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