尹麗君，郭慧，周乃珍，倪旻，張盛周

安徽師范大學生命科學學院，安徽 蕪湖 241000

0 引言

直隸環(huán)毛蚓（Pheretima tschiliensis Michaelsen 1928）是環(huán)節(jié)動物門（Annelida）寡毛綱（Oligochaeta）后孔寡毛目（Opisthopora）巨蚓科環(huán)毛蚓屬（Pheretima）的一種。環(huán)毛蚓屬是巨蚓科最大﹑最常見的一屬，它具有改良土壤肥力﹑凈化環(huán)境﹑處理垃圾等重要作用，可作為家禽﹑魚類等的高蛋白飼料的來源，此外，還具有解熱﹑鎮(zhèn)痙﹑平喘等藥理作用，具有很高的經(jīng)濟價值。人工養(yǎng)殖蚯蚓近年來已經(jīng)發(fā)展成一個新興的養(yǎng)殖項目，具有寬廣的市場前景。

研究直隸環(huán)毛蚓消化酶活力情況，可了解消化道不同部位的消化能力。目前，對蚯蚓消化的研究，有關(guān)于消化道機構(gòu)的基礎(chǔ)研究，包括臟體腔膜的特化黃色細胞都有研究，消化酶同工酶酶譜分析為確定蚯蚓在進化水平上的親緣關(guān)系及分類學提供了證據(jù)，不同生態(tài)位的蚯蚓間通過其消化酶分布的種間差異反映環(huán)境適應性，還通過研究某些酶的含量變化推斷環(huán)境的污染程度。對蚯蚓酶方面的研究，針對具有高應用價值的纖溶酶和蚓激酶的研究比較多。對于直隸環(huán)毛蚓這7種酶在消化道的酶活力分布情況的研究未見報道。本文在檢測直隸環(huán)毛蚓消化道堿性磷酸酶，酸性磷酸酶，過氧化物酶，脫氫酶，ATP酶，酯酶，脂酶等7種酶的活力狀況的基礎(chǔ)上，探究酶分布情況與各部位消化機能之間的聯(lián)系，為蚯蚓的養(yǎng)殖及利用提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

直隸環(huán)毛蚓3條，體長平均為14 cm，體重平均2.3g。采自安徽師范大學校園內(nèi)。

1.2 實驗方法

1.2.1 消化酶活力測定

將直隸環(huán)毛蚓侵入70%酒精中處死，按口﹑咽﹑食道﹑嗉囊﹑砂囊﹑胃﹑腸﹑盲腸﹑直腸﹑肛門迅速取材并放置于-20℃冰箱中，組織切片采用冰凍切片，保證酶的活力。冰凍切片機為德國萊卡CM1900，切片厚度為7μm。

7種酶組織化學染色的方法如下：

1） Gomori法：酸性磷酸酶作用液成分為醋酸緩沖液（醋酸鈉﹑冰醋酸，pH4.7）﹑5%Pb（NO3）2 ﹑3.2%β-甘油磷酸鈉。37℃條件下，切片在作用液中孵育2h。蒸餾水浸洗數(shù)次，再將玻片浸入1%硫化銨2min～3 min。蒸餾水沖洗后蘇木精復染；

2）堿性磷酸（酯）酶作用液成分為堿性磷酸酶緩沖液（氯化鈉﹑氯化鎂﹑Tris， pH9.2～9.4）﹑四唑硝基藍（NBT）﹑5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽（BCIP）。這一生色混合液在30 min內(nèi)使用。材料浸在作用液中顯色20 min，蒸餾水浸洗；

3）過氧化物酶作用液成分為二氨基聯(lián)苯胺或聯(lián)苯二胺（DAB）﹑TBS（Tris（Tris堿）， NaCl，pH7.6）﹑H2O2（30%）。材料浸入作用液中孵育1 h；

4）脫氫酶作用液成分為噻唑藍（MTT）﹑PBS。材料浸入作用液中孵育2 h；

5）三磷酸腺苷酶作用液為三磷酸腺苷鈉鹽﹑0.2mol/L Tris-HCl緩沖液（pH7.2）﹑2%硝酸鉛﹑0.1mol/L硫酸鎂混合后取得的上清液， 將材料置于作用液中孵育1h～3 h，蒸餾水浸洗3次，在1%硫化銨中浸1 min，蒸餾水洗凈；

6）酯酶作用液成分為α-醋酸萘酯﹑PBS﹑Schiff試劑。材料浸入作用液中孵育1 h，流水沖洗，蘇木精復染，蒸餾水洗數(shù)次。（文獻 Pearse A G E. Histochemistry ，theoretical and applied. 4th edition. London ∶Churchill Livingastone ，1983 引用酶檢測方法都引用的這個文獻，我只找到了一個文獻截圖，見引用文獻文件夾—方法文獻）；

7）脂酶作用液成分為 0.5mol/LTris緩沖液（pH7.2～7.4）﹑10%CaCl2﹑ 5%Tween60。將材料置于作用液中孵育3h～12 h，蒸餾水浸洗3次，浸入1%硝酸鉛溶液中15min，再在1%～2%硫化銨中浸1min～2 min，蘇木精復染，蒸餾水洗凈。

按上述處理后將玻片放入恒溫干燥箱內(nèi)烘干，樹膠封片，再放入恒溫干燥箱內(nèi)烘干，在Olympus BH-2型顯微鏡下觀察﹑照相。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理與分析

采用圖像分析軟件Image-Pro Plus對照片進行光密度分析，測出各種組織中酶染色沉淀的累積光密度（integrated optical density，IOD）和面積（area），得出實驗數(shù)據(jù)平均光密度（mean optical density，MOD）。

對實驗數(shù)據(jù)的處理由SPSS軟件統(tǒng)計完成，采用單因素方差分析（0ne-Way ANOVA），多重比較選“LSD”和“S-N-K”比較并確定檢驗的差異顯著性概率臨界值0.05。

2 結(jié)果

組織化學染色顯示7種酶在直隸環(huán)毛蚓消化道各段均有分布；光密度分析表明，7種酶的酶活力在直隸環(huán)毛蚓消化道各段存在較大差異（表1）。

表1 七種酶在直隸環(huán)毛蚓消化道中的酶活力情況（以MOD為單位）

2.1 酸性磷酸酶（ACP）

酸性磷酸酶（ACP）的反應產(chǎn)物為棕黑色（圖1﹑2）。酸性磷酸酶在嗉囊﹑砂囊﹑胃和腸道等部位酶活力較高，其中以腸道中最高，在口﹑咽﹑肛門和盲腸等消化道前端和后端酶活力較低。在腸的上皮層﹑肌肉層﹑臟體腔膜中均有分布。

2.2 堿性磷酸酶（AKP）

堿性磷酸酶（AKP）反應產(chǎn)物為藍紫色（圖3﹑4）。堿性磷酸酶在消化道各部位中酶活力情況有顯著的差異，在腸﹑盲腸這兩個部位反應產(chǎn)物呈現(xiàn)很深的藍紫色，光密度分析的數(shù)值也相應較大，明顯比其他部位酶活力高。在腸﹑盲腸堿性磷酸酶分布密度大的區(qū)域主要集中在上皮層中。在直腸中的酶活力次之，而在其他部位中的分布量均極少，在胃﹑口﹑嗉囊﹑食道﹑肛門﹑咽﹑砂囊中酶活力依次減少，其中在砂囊中幾乎沒有檢測到堿性磷酸酶活力。

2.3 脫氫酶（dehydrogenases）

脫氫酶（dehydrogenases）反應產(chǎn)物為棕黃色（圖5﹑6）。脫氫酶在腸﹑直腸﹑砂囊中分布較多，其他部位均較少，在咽﹑食道﹑盲腸﹑肛門酶活力依次減少其中肛門最低。酶主要位于消化道壁的肌肉層和臟體腔膜上，尤其是臟體腔膜上的黃色細胞中分布密度較大。

2.4 過氧化物酶（Peroxidase）

過氧化物酶（Peroxidase）反應產(chǎn)物為棕黃色（圖 7﹑8）。過氧化物酶在腸中分布最多，尤其在腸的固有層﹑粘膜下層和臟體腔膜中。盲腸﹑直腸次之，其中盲腸的臟體腔膜的酶活性強，直腸的粘膜下層酶活性強。其他部位口﹑咽﹑食道﹑嗉囊﹑胃﹑肛門﹑砂囊分布較少。食管主要在臟體腔膜中有酶活性，胃中在粘膜肌層和粘膜下層出現(xiàn)酶活性，砂囊角質(zhì)層內(nèi)側(cè)顯示出酶活性。

2.5 ATP酶（ATPase）

ATP酶（ATPase）反應產(chǎn)物為棕黑色（圖9﹑10）。ATP酶的分布在消化道前段的部位中較多，后段較少。其中嗉囊﹑砂囊﹑食道﹑口﹑咽中分布較多，多出現(xiàn)在肌肉層，胃﹑肛門﹑直腸﹑腸中活性較少其中胃的酶活性出現(xiàn)在粘膜肌層，盲腸中最少。

2.6 酯酶（esterase）

酯酶（esterase）反應產(chǎn)物為紅棕色（圖11﹑12）。酯酶在盲腸﹑腸﹑直腸﹑胃中分布較多，其中在盲腸中酶活性出現(xiàn)在臟體腔膜，在腸的肌肉層，上皮和內(nèi)含物中都顯示較強的酶活性，直腸肌層出現(xiàn)酶活性，胃中則明顯的只在縱肌層，在砂囊中較少，咽﹑食道﹑嗉囊﹑口﹑肛門的部位分布極少

2.7 脂酶（Lipase）

脂酶（Lipase）反應產(chǎn)物為棕黑色（圖13﹑14）。脂酶在消化道的分布較均勻，其中腸﹑砂囊﹑盲腸中分布較多在各層出現(xiàn)反應沉淀物即酶活性在各層均有分布，肛門﹑嗉囊﹑胃﹑咽次之，口﹑直腸﹑食道最少。

3 討論

酸性磷酸酶（ACP）廣泛存在于生物界，是一種磷酸酯酶，在酸性條件下催化磷酸單酯的水解。ACP在細胞內(nèi)多位于溶酶體內(nèi)，也見于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復合體上。據(jù)以往報道，不同生物組織中的ACP在消化﹑免疫防御﹑生殖﹑細胞凋亡﹑細胞增殖﹑能量轉(zhuǎn)換﹑信號傳導中起重要作用[1-2]。由上結(jié)果表明，酸性磷酸酶在消化道的腸中分布最多，說明直隸環(huán)毛蚓的腸在消化吸收過程中起重要作用。這與孫建梅等發(fā)現(xiàn)在文昌魚的腸中有很強ACP活性并參與其消化吸收[3]有相似性。

堿性磷酸酶是一種膜結(jié)合磷酸酯酶，是一種含鋅糖蛋白。在堿性條件下，催化磷酸單酯化合物底物使其去磷酸化的水解反應。堿性磷酸酶與磷代謝﹑物質(zhì)的跨膜運輸 ﹑離子分泌﹑機體防御和軟骨鈣化等生命活動相關(guān)。它的存在與該部位的吸收能力密切相關(guān)[4-6]。由上結(jié)果可以觀察出，堿性磷酸酶在直隸環(huán)毛蚓消化道中腸﹑盲腸分布明顯居多，且在粘膜上皮的分布密度大。由此可以推測蚯蚓的腸為主要消化吸收部位，盲腸為主要分泌器官。而砂囊中呈現(xiàn)顯著的陰性反應，這可能是由于砂囊內(nèi)壁為堅硬的角質(zhì)層而非膜結(jié)構(gòu)，堿性磷酸酶與膜結(jié)合的性質(zhì)導致其在砂囊中極少存在，證實砂囊的主要功能是研磨食物漿狀食糜，而非消化吸收的場所。這種情況同樣出現(xiàn)在在許氏平鲉[7]的消化道中。魚類有關(guān)酶的研究較多，如麥瑞加拉鯪魚在消化道的粘膜上皮均有這種酶的分布并且在消化道各部位都很明顯[8]。鱈魚堿性磷酸酶具有廣泛的分布，主要定位在小腸，一般在固有層中，但主要是在腸的紋狀緣[9]。魚類的消化道各段分布廣泛這與直隸環(huán)毛蚓只在腸和忙囊中分布多有差異，但在腸的粘膜層﹑固有層密度大這點有相似性。

脫氫酶是一類催化物質(zhì)氧化還原反應的酶，在酶學分類中屬于第一大類。生物體中絕大多數(shù)氧化還原反應都是在脫氫酶及氧化酶的催化下進行[10]。由上結(jié)果表明，脫氫酶在消化道腸﹑直腸﹑砂囊部位分布密度較大。本實驗所測脫氫酶為非特異性的，據(jù)報道，在鼠胃﹑腸上皮是醇脫氫酶（ADH）活性的主要場所[11]，可推測直隸環(huán)毛蚓腸中脫氫酶活性較高可能為醇脫氫酶（ADH）。在砂囊的肌肉壁中脫氫酶活性高可能與日本杜拉蚓或其他物種的肌肉中乳酸脫氫酶（LDH）較高相似[12-14]，因此推測砂囊中的脫氫酶可能為乳酸脫氫酶，它可能同樣起到催化丙酮酸向乳酸的轉(zhuǎn)化，完成糖酵解的過程，為機體在缺氧條件下提供必要的能量的作用。

過氧化物酶（POD）是廣泛存在于動植物體內(nèi)﹑含血紅素（鐵卟啉）輔基的氧化還原酶，可水解氧化還原反應中產(chǎn)生的細胞毒性物質(zhì)過氧化氫﹑嘌呤﹑酚﹑胺類等，從而降低其毒性，對細胞起保護作用[15]。還與脂類代謝有關(guān)[16]。由上結(jié)果表明，過氧化物酶在整個消化道均有分布。在腸﹑直腸﹑盲腸﹑胃中分布較多，多位于固有層和粘膜下層，是參與脂類代謝和解毒作用的部位。這種酶響應逆境脅迫，因此很多研究致力于毒性物質(zhì)對過氧化物酶的誘導情況，張薇等（2009）對蚯蚓的研究表明，蚯蚓的過氧化物酶（POD）在 BaP 的最大暴露質(zhì)量濃度下（10-2mg～mL-1）被顯著誘導[17]。

ATP酶（ATPase）是普遍存在于組織細胞及細胞器膜上的一種蛋白酶，主要作用是通過水解ATP 釋放能量，進行逆化學梯度的離子轉(zhuǎn)運，維持細胞內(nèi)外離子濃度的相對穩(wěn)定，以保證能量代謝的需要，具有重要的生理意義[18]。嗉囊﹑砂囊﹑食道中分布較多，這一分布情況與Dev B，Vyas I.的發(fā)現(xiàn)[19]一致。其中砂囊中的ATP酶較多，可能是由于其行使的主要功能是通過肌肉的收縮﹑不斷擠壓食物將其磨碎，肌肉壁收縮蠕動這一過程是耗能過程，因此需要較多的ATP酶水解放能。 從ATP酶分布來看，主要集中在消化道前段，后段較少，可能跟消化道的前端主要是對食物進行機械消化的初步消化，消化道后段包括腸﹑盲腸等則是主要對事物進行化學性消化和營養(yǎng)物質(zhì)吸收為主有關(guān)系。

酯酶（Esterase）是一種水解酶，經(jīng)由水解作用，將酯類切割成 酸類與醇類[20～21]由上結(jié)果表明，酯酶在胃﹑腸﹑盲腸﹑直腸中分布較多，推測與酯類的消化吸收相關(guān)。不同物種的酯酶分布有相似性，蝦蛄中腸粘膜上皮細胞也有酯酶活性[22]。

脂酶（Lipase）屬脂肪分解酶類。它的基本作用是使三甘油酯水解為甘油和脂肪酸。與生物體內(nèi)的脂質(zhì)代謝有密切的關(guān)系。實驗結(jié)果表明[23～25]，脂酶在砂囊﹑腸中分布較多，可見，脂酶參與的脂類消化吸收作用主要發(fā)生在腸道。據(jù)研究報道，脂肪酸的濃度檢測表明是脂肪酸主要集中在蚯蚓的腸中，尤其是后腸[26]。由于酯酶分解的主要產(chǎn)物為脂肪酸，因此這與本實驗的結(jié)果一樣都證實了腸道的脂肪酶含量較多，但文章中提及微生物種群密集在蚯蚓腸道中部位與脂肪酸的密集部位相同，可能互利共生地協(xié)助蚯蚓的消化過程。因此這里我們檢測到的酯酶很有可能是腸道微生物種群分泌到菌體外的酯酶和蚯蚓腸道上皮分泌的酯酶的總和。

直隸環(huán)毛蚓的腸內(nèi)檢測出多種酶的較強活性，除本實驗所測酶外還分布有蛋白酶﹑淀粉酶﹑蔗糖酶﹑纖維素酶﹑尿素酶等[27]，因此可見消化及吸收功能主要在腸內(nèi)進行。自第26體節(jié)開始，腸兩側(cè)向前伸出一對錐狀盲腸（caeca），能分泌多種酶，為重要的消化腺。

圖1 酸性磷酸酶在咽中的分布

圖2 酸性磷酸酶在腸中的分布

圖3 堿性磷酸酶在砂囊中的分布

圖4 堿性磷酸酶在盲腸中的分布

圖5 脫氫酶在肛門中的分布

圖6 脫氫酶在直腸中的分布

圖7 過氧化物酶在胃中的分布

圖8 過氧化物酶在腸中的分布

圖9 ATP酶在盲腸中的分布

圖10 ATP酶在砂囊中的分布

圖11 酯酶在食管中的分布

圖12 酯酶在胃中的分布

圖13 脂酶在食管中的分布

圖14 脂酶在砂囊中的分布

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