賈存慧，禹立霞，魏嘉，鄒征云，錢曉萍，劉寶瑞

0 引言

胃癌是我國高發(fā)的消化道腫瘤之一，病死率在惡性腫瘤中居第2位，進(jìn)展期胃癌患者手術(shù)切除后的5年生存率僅為20%左右。以全身化療為主的綜合治療是目前進(jìn)展期胃癌的重要治療方法，常見化療藥物主要是鉑類、紫杉類、氟脲嘧啶類、喜樹堿類、蒽環(huán)類等類藥物，聯(lián)合化療有效率多在50%以下。如何提高化療藥物療效、盡可能避免無效化療及提高總生存期是我們目前亟待探討和解決的問題。MGMT能夠特異性地修復(fù)烷化劑對DNA造成的損傷，同時(shí)也是逆轉(zhuǎn)烷化劑如替莫唑胺、司莫司汀等抗腫瘤作用的關(guān)鍵酶。隨著藥物遺傳學(xué)/藥物基因組學(xué)在化療藥物作用機(jī)制等方面的研究獲得了突破性進(jìn)展，研究者發(fā)現(xiàn)化療藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)與特定的一種(一組)基因或蛋白的表達(dá)顯著相關(guān)。通過相應(yīng)的檢測結(jié)果，預(yù)測該化療藥物的療效，選擇合適的藥物進(jìn)行化療，已經(jīng)成為提高療效、減少無效治療的合理選擇［1］。關(guān)于MGMT與腫瘤的關(guān)系雖有文獻(xiàn)報(bào)道，但是MGMT在進(jìn)展期胃癌患者中表達(dá)的相關(guān)性研究，特別是采用較為精確的免疫組化量化評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)在國內(nèi)報(bào)道不多。我們采用免疫組化SP法探討MGMT在進(jìn)展期胃癌患者腫瘤組織中的表達(dá)，分析其表達(dá)情況與胃癌臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，也為可能的個(gè)體化藥物治療提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象收集158例2004至2008年間行胃癌根治術(shù)，經(jīng)病理確診并具有隨訪結(jié)果的手術(shù)切除患者的臨床資料?；颊咧心?26例，女32例，年齡33～92歲，中位年齡64.5歲。所有患者術(shù)前均未接受任何放療和化療。

1.2 切片制備將晚期患者的胃癌組織標(biāo)本經(jīng)10%的甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，行連續(xù)切片，厚度為4 μm，載玻片經(jīng)多聚賴氨酸處理，防止脫片。其中一張用于HE染色和病理診斷，其余切片于60℃烤片2 h并儲(chǔ)存，待隨后進(jìn)行免疫組化染色。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及免疫組化方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)試劑小鼠抗人MGMT單克隆抗體(ZM-0461)，工作濃度為1∶100，二抗試劑盒PV-6000-G(二步法免疫組化檢測試劑)，DAB顯色劑均購自北京中杉金橋公司。0.01 mmol/L PBS代替一抗作為陰性對照，以公司提供的陽性切片作為陽性對照。

1.3.2 免疫組化方法主要步驟包括梯度乙醇脫蠟，5%H2O2室溫放置15 min以滅活內(nèi)源性酶，檸檬酸緩沖液(pH6.0)中微波抗原修復(fù)12 min

后，置室溫冷卻30 min，一抗4℃冰箱孵育過夜，然后按SP試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，自來水充分沖洗，梯度乙醇二甲苯脫水透明，中性樹膠封固。

1.4 免疫組化結(jié)果判定方法MGMT的陽性表達(dá)主要在細(xì)胞核中，部分表達(dá)存在于細(xì)胞質(zhì)或兩者均有表達(dá)。采用盲法觀察切片，根據(jù)陽性染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)比率綜合計(jì)分［2-3］:陽性染色強(qiáng)度無染色為0分，弱陽性為1分，中度陽性為2分，強(qiáng)陽性為3分，并分別記錄上述各個(gè)染色強(qiáng)度的陽性細(xì)胞百分率。將染色強(qiáng)度分值與相應(yīng)染色強(qiáng)度的陽性細(xì)胞百分率相乘得到最終的評分結(jié)果，分值范圍在0～300之間。評分公式為:

分值=0×a%+1×b%+2×c%+3×d%其中a、b、c、d分別為0分、1分、2分、3分細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)。此種判定方法能夠定量判定免疫組化的結(jié)果，更大程度避免主觀因素造成的誤差。結(jié)果判定在不了解患者臨床資料的情況下進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組間等級資料比較采用秩和檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法及COX回歸模型，雙變量等級資料的關(guān)聯(lián)性分析采用Spearman等級相關(guān)性分析，數(shù)據(jù)分析用SAS 9.1.3統(tǒng)計(jì)軟件包，以P≤0.05為有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌中MGMT蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系158例胃癌組織中，121例MGMT蛋白為陽性染色，陽性率為76.58%，陽性顆粒主要位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核中，少數(shù)位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，間質(zhì)中部分淋巴細(xì)胞為陽性表達(dá)，且MGMT低表達(dá)組和MGMT高表達(dá)組的陽性表達(dá)有明顯不同，見圖1。MGMT蛋白陽性表達(dá)與患者的腫瘤部位、腫瘤大小、腫瘤分期、分化程度、神經(jīng)是否侵犯、脈管是否存在癌栓均無相關(guān)性(P＞0.05)，見表1。

2.2 MGMT蛋白表達(dá)與胃癌預(yù)后的關(guān)系158例患者中，我們根據(jù)上述免疫組化判定標(biāo)準(zhǔn)對MGMT表達(dá)情況進(jìn)行評分，根據(jù)評分的結(jié)果，將陽性表達(dá)的病例按評分結(jié)果劃分為低表達(dá)(分值≤30，n=61)和高表達(dá)(分值＞30，n=60)，30分為所有分值的中位值。MGMT低表達(dá)患者的中位總生存期為14.2個(gè)月，而高表達(dá)患者的中位總生存期為13.4個(gè)月，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。生存曲線圖見圖2。

表1 胃癌組織中MGMT蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 1 The relationship between MGMT protein expression and the clinicopathological features of advanced gastric carcinoma

由圖2可知，以MGMT表達(dá)分值的中位值30劃分得到的低表達(dá)和高表達(dá)的總生存期曲線差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。MGMT陽性表達(dá)組生存期與MGMT陰性表達(dá)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。

圖1 MGMT蛋白在進(jìn)展期胃癌組織中的表達(dá)情況Figure 1 The expression of MGMT protein in advanced gastric carcinoma tissues

圖2 MGMT蛋白表達(dá)情況與進(jìn)展期胃癌患者生存期的關(guān)系Figure 2 The relationship between MGMT protein expression and OS of advanced gastric carcinoma patients

2.3 聯(lián)合分析MGMT蛋白表達(dá)和p53蛋白表達(dá)與進(jìn)展期胃癌患者預(yù)后的關(guān)系結(jié)合病例標(biāo)本的臨床病理檢測結(jié)果，我們聯(lián)合分析了MGMT蛋白和p53蛋白的表達(dá)情況與胃癌患者總生存期之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)MGMT(+)、p53(-)組的總生存期要明顯長于MGMT(+)、p53(+)組，P＜0.05，見圖3。

接著，我們進(jìn)一步分析了根據(jù)MGMT陽性表達(dá)情況所劃分的低表達(dá)組和高表達(dá)組的胃癌患者的總生存期，見圖4。當(dāng)p53(-)、MGMT低表達(dá)組的總生存期與MGMT高表達(dá)組的總生存期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);當(dāng)p53(+)、MGMT低表達(dá)組的總生存期要顯著高于MGMT高表達(dá)組(P＜0.05)。

圖3 聯(lián)合分析MGMT和p53的表達(dá)與進(jìn)展期期胃癌患者生存期的關(guān)系Figure 3 Combined evaluation the relationship between the expression of MGMT and p53 and OS of advanced gastric carcinoma patients

圖4 聯(lián)合分析MGMT低表達(dá)組、高表達(dá)組和p53的表達(dá)與晚期胃癌患者生存期的關(guān)系Figure 4 Combined evaluation the relationship amongMGMT low expression group，high expression group and p53 and OS of advanced gastric carcinoma patients a:p53(+);b:p53(-)

2.4 MGMT蛋白表達(dá)與p53蛋白表達(dá)之間的關(guān)系Spearman相關(guān)系數(shù)分析顯示MGMT蛋白和p53蛋白的蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān):r=-0.2534，P=0.0023，見表2。

表2 MGMT和p53蛋白表達(dá)相關(guān)性分析Table 2 The relationship between the expression of MGMT ptotein and p53 protein

2.5 多變量分析各參數(shù)與患者預(yù)后的關(guān)系多變量COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析，MGMT(P=0.1363)和p53(P=0.4082)不能作為生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)(MGMT的相對危險(xiǎn)度:1.339;p53的相對危險(xiǎn)度:1.174)。見表3。

表3 COX回歸多因素分析與患者總生存期關(guān)系Table 3 The relationship between Cox regression analysis and OS of advanced gastric carcinoma patients

3 討論

MGMT蛋白是由MGMT基因編碼的207個(gè)氨基酸組成的含磷蛋白，能夠特異性地修復(fù)鳥嘌呤第6位氧原子烷基化對DNA造成的損傷，在維持正常細(xì)胞的生理功能和基因組的穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用［3］。MGMT在人體的正常組織和多種腫瘤組織中均有表達(dá)(稱Mer+表型)，并且部分腫瘤組織中的MGMT蛋白活性低于其在相應(yīng)的正常組織中的活性。有20%的腫瘤細(xì)胞株檢測不到MGMT的表達(dá)(稱Mer-表型)［4］。MGMT蛋白的活性減少或缺失、MGMT mRNA的表達(dá)缺失及其酶活性的缺失與MGMT基因的異常表達(dá)密切相關(guān)，特別是MGMT基因的啟動(dòng)子區(qū)的超甲基化狀態(tài)［5］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化異常在結(jié)腸癌、腦膠質(zhì)瘤、黑色素瘤和胃癌等腫瘤組織中均有發(fā)生［6-9］。Bartchewsky等［3］對64例胃癌患者的MGMT基因和蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測，胃癌患者的MGMT蛋白活性顯著降低，根據(jù)免疫組化定量判斷評分標(biāo)準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)MGMT在胃癌組織中的表達(dá)平均分值為14.52，遠(yuǎn)低于臨近的正常胃黏膜組織中的60.33，提示胃癌中MGMT蛋白的表達(dá)減少可能與MGMT基因的異常表達(dá)有關(guān)。近年來，研究發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤患者的MGMT基因的啟動(dòng)子區(qū)如果出現(xiàn)高甲基化，那么對于替莫唑胺的敏感性會(huì)顯著提高，可能從化療中更多的獲益，并且患者的總生存期也有所延長［10］。提示MGMT的甲基化狀態(tài)或者M(jìn)GMT蛋白的表達(dá)可能作為腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的預(yù)測因子和替莫唑胺的敏感性指標(biāo)。目前對于該蛋白的表達(dá)與胃癌化療敏感性及預(yù)后的相關(guān)關(guān)系研究較少。

p53基因是一種重要的抑癌基因，其蛋白產(chǎn)物p53蛋白的抑制活性由多種因素調(diào)節(jié)，如p53凋亡刺激蛋白(apoptosis stimulating protein of p53，ASPP)家族等，并且在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中處于關(guān)鍵環(huán)節(jié)［11-12］。當(dāng)其發(fā)生突變或缺失時(shí)，抑癌效應(yīng)削弱，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。同時(shí)，p53蛋白的半衰期明顯延長，可用免疫組化方法在多種腫瘤組織中檢測到突變型p53蛋白。而p53蛋白的突變多發(fā)生于CpG序列，特別是G:C→A:T的轉(zhuǎn)變［13］。Wu等［14］研究證實(shí)，MGMT蛋白的活性表達(dá)能夠阻止p53基因G:C→A:T的突變，對p53基因進(jìn)行保護(hù)。而當(dāng)啟動(dòng)子處于高甲基化時(shí)，突變型p53蛋白增加，可以通過免疫組化進(jìn)行檢測。本研究表明MGMT蛋白與p53蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.2534，P=0.0023)，提示MGMT的活性表達(dá)對p53基因具有保護(hù)作用，當(dāng)MGMT蛋白表達(dá)為陰性或低表達(dá)時(shí)可能會(huì)增加p53基因的突變頻率，進(jìn)而導(dǎo)致p53蛋白的表達(dá)增強(qiáng)。Wiewrodt等［15］對復(fù)發(fā)性腦膠質(zhì)瘤患者在放化療后的MGMT表達(dá)和p53狀態(tài)以及預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)MGMT低表達(dá)和p53陽性表達(dá)具有一定的相關(guān)性趨勢，且MGMT蛋白表達(dá)量＜30 fmol/mg時(shí)，能夠更好地從烷化劑的治療以及放療中獲益。

基于以上研究的提示，我們收集了158例進(jìn)展期胃癌患者臨床手術(shù)標(biāo)本，采用免疫組化的方法檢測腫瘤組織中MGMT蛋白的表達(dá)情況，并聯(lián)合p53蛋白的臨床檢測結(jié)果進(jìn)行綜合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，MGMT蛋白的陽性率為76.58%(121/158)，與文獻(xiàn)報(bào)道相近［16］。中分化型和中-低分化型胃癌組織中MGMT的陽性表達(dá)率高于低分化型胃癌組織中MGMT的陽性表達(dá)率。

同時(shí)，根據(jù)隨訪資料對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行生存分析，陽性表達(dá)的病例被劃分為低表達(dá)(分值≤30，n=61)和高表達(dá)(分值＞30，n=60)。對免疫組化結(jié)果所采取的判斷標(biāo)準(zhǔn)相較于以往的評判標(biāo)準(zhǔn)而言，能夠更為定量的分析MGMT蛋白的表達(dá)情況，更大程度地避免一些人為因素的影響，增加了結(jié)果的可信度。MGMT低表達(dá)患者的中位總生存期為14.2個(gè)月，而高表達(dá)患者的中位總生存期為13.4個(gè)月，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但由于檢測的病例均為進(jìn)展期胃癌，患者的身體機(jī)能狀況可能是其生存期長短的重要影響因素，在一定程度上影響了實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。根據(jù)COX回歸模型分析結(jié)果，MGMT和p53均不能作為生存期的獨(dú)立預(yù)測因素(P＞0.05)。因此，我們聯(lián)合分析了MGMT蛋白表達(dá)和p53蛋白表達(dá)與患者總生存期之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)MGMT(+)、p53(-)組的總生存期要明顯長于MGMT(+)、p53(+)組(P＜0.05)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示我們單獨(dú)以MGMT的表達(dá)情況作為胃癌患者的預(yù)后指標(biāo)的敏感性遠(yuǎn)較腦膠質(zhì)瘤低。

近年來，諸多文獻(xiàn)報(bào)道腦膠質(zhì)瘤中MGMT的表達(dá)情況對于患者個(gè)體化用藥的具有一定指導(dǎo)作用，特別是替莫唑胺［16-17］。提示應(yīng)對胃癌患者M(jìn)GMT的表達(dá)在指導(dǎo)個(gè)體化用藥上是否也存在參考意義進(jìn)行研究，結(jié)果有23.42%的胃癌患者腫瘤組織中不表達(dá)MGMT蛋白，38.61%的胃癌患者M(jìn)GMT低表達(dá)。是否這些胃癌患者可以從替莫唑胺的治療中獲益是今后需要深入探討和回答的問題。在我們的臨床實(shí)踐中，有1例賁門中分化腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者，已行多方案化療及放療后再度出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，提示腫瘤繼發(fā)性耐藥，預(yù)計(jì)治療效果不佳。而胃癌的全身化療無標(biāo)準(zhǔn)三線方案，結(jié)合患者入院前免疫組化MGMT檢測結(jié)果為陰性，考慮嘗試使用了替莫唑胺抗腫瘤治療。結(jié)果患者于1個(gè)化療周期后即達(dá)到部分緩解，提示胃癌治療中根據(jù)MGMT蛋白的表達(dá)情況選擇是否選用替莫唑胺，對患者的病情控制可能會(huì)發(fā)揮一定作用。通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合檢測p53蛋白和MGMT蛋白在胃癌患者腫瘤組織中的表達(dá)情況，可能更有助于判斷患者的化療療效和預(yù)后，指導(dǎo)臨床治療中根據(jù)患者M(jìn)GMT的表達(dá)情況選擇化療藥物，對于MGMT表達(dá)評分較低，p53為高表達(dá)的患者可以考慮選擇含有烷化劑的化療方案，根據(jù)不同的患者情況制訂個(gè)體化的治療方案，可使患者從化療中得到更多的獲益。

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