于 露 (荊州市環(huán)境保護局,湖北荊州434000)

李凡修 (長江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,湖北荊州434023)

1 分光光度法

2)甲苯胺藍光度法 何戰(zhàn)勝等[5]研究發(fā)現(xiàn)羥自由基可與甲苯胺藍發(fā)生氧化反應(yīng),且在612nm處羥自由基對甲苯胺藍溶液具有強烈的褪色作用,能使甲苯胺藍的吸光發(fā)生變化,提出了間接檢測Fenton反應(yīng)中羥自由基濃度的新方法。研究發(fā)現(xiàn),最佳測定條件為pH=4.0。該法穩(wěn)定性好,操作簡便,測定快速,是篩選抗羥自由基的清除劑和有效抗氧化劑藥物的簡便方法。

4)丁基羅丹明B法 丁基羅丹明B無論在酸性介質(zhì)中,還是在堿性介質(zhì)中均顯紅色,但在稀硫酸介質(zhì)中,羥自由基與丁基羅丹明B發(fā)生反應(yīng),使丁基羅丹明B褪色。翟繼英[7,8]在722型分光光度計480～620nm范圍內(nèi)測定丁基羅丹明B的吸光度,發(fā)現(xiàn)最大吸收波長在554nm處,因此可利用722型光度計上554nm處吸光度的變化,間接測定羥自由基的生成量。

6)萃取-催化氧化光度法 稀土元素的氧化物溶液能催化過氧化氫產(chǎn)生羥基自由基(OH),OH可氧化二苯基碳酰肼生成紅色二苯基碳酰腙,經(jīng)CHCl3萃取后,其萃取液在最大吸收波長563nm處,ΔA563與過氧化氫、稀土的量呈量效關(guān)系。劉德啟[14]利用上述原理建立萃取-催化氧化光度法測定H2O2的羥基自由基的新方法。在好氧生物體過氧化氫含量的實際水平范圍內(nèi),該法在離體篩選抗氧劑方面更接近生物體過氧化氫含量的水平,比Fenton試劑要靈敏的多。該法具有儀器簡單、體系穩(wěn)定、操作方便等優(yōu)點,非常適合于篩選羥基自由基消除劑。

另外利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基與染料試劑溴甲酚綠 (Bromocresol green,B G)[15]、溴鄰苯三酚紅、桑色素等發(fā)生氧化反應(yīng)后使其吸光度值降低,都可建立間接測定羥基自由基的方法[8]。賈之慎等用水揚酸捕獲OH后,與Na2WO4和NaNO2顯色,510nm比色測定,間接測定羥自由基含量。徐向榮等[9]用DMSO捕獲OH形成甲基亞磺酸,在420nm比色測定Fe2+-H2O2體系產(chǎn)生的OH,上述方法均可用于羥自由基清除劑的篩選。

2 熒光光度法

1)苯基熒光酮熒光法 苯基熒光酮 (Phenylfluorone,簡稱本芴酮)與Fenton試劑作用后,可使其熒光大大降低,其最大激發(fā)波長和發(fā)射波長分別500nm和420nm,基于苯基熒光酮在反應(yīng)前后的熒光變化,吳南等建立了一種新的可間接地測定羥自由基方法,并通過順磁共振法測定苯基熒光酮加入前后的波譜變化來進一步證實該方法的正確性。該方法具有較高的靈敏度,可作為尋找羥自由基清除劑的方法,也可作為醫(yī)學(xué)上部分藥品性能檢驗的有效方法。

在此基礎(chǔ)上,任風蓮等[16]提出了一種快速、簡便地測定Sn(Ⅱ)-H2O2體系產(chǎn)生羥自由基 (OH)的新方法。由于Sn2+可與H2O2作用發(fā)生類似Fenton反應(yīng),產(chǎn)生大量羥自由基,采用苯基熒光酮phenylfluorone作為Sn(Ⅱ)-H2O2反應(yīng)體系的熒光試劑,再利用其產(chǎn)生的羥自由基氧化苯基熒光酮,使苯基熒光酮的強度發(fā)生變化,可間接地測定羥自由基的產(chǎn)生量。苯基熒光酮熒光法對儀器要求低,方法簡便,操作易行,選擇性好,準確可靠,是一種值得推廣的新型測定羥自由基的有效方法,特別適用于檢測離體體系中羥自由基的氧化效應(yīng)及其清除羥自由基的機理研究。

2)吡啶熒光法 谷學(xué)新等[17]利用羥基自由基氧化二甲亞砜 (DMSO)生成的甲醛與乙酰丙酮、氨發(fā)生Hantzsch反應(yīng),其產(chǎn)物3,5-二乙酰-1,4-二氫吡啶可產(chǎn)生特征熒光,其最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長分別為419.4nm和505.5nm,通過測定熒光強度的變化可間接定量羥基自由基的產(chǎn)生量。該方法簡便可靠,不需昂貴儀器,操作簡便,易于被一般實驗室采用,對于抗氧化劑的篩選以及羥基自由基的機理研究具有一定的應(yīng)用價值。

3)楊基熒光酮熒光法 水楊基熒光酮 (salicylfluorone,SAF)是一種多羥基芳香酮,由于具有多羥基及較好的剛性平面結(jié)構(gòu),它本身就能產(chǎn)生熒光,因此任何改變其結(jié)構(gòu)的變化都能改變它的熒光。基于以上原理,Fenton試劑產(chǎn)生的羥自由基與水楊基熒光酮SAF作用后,可生成另外一種熒光物質(zhì),從而發(fā)生了熒光的變化,可利用熒光強度變化來間接測定所產(chǎn)生的羥自由基[18]。

任鳳蓮[19]實驗中發(fā)現(xiàn)Co2+與H2O2反應(yīng)生成羥自由基的產(chǎn)率比Fenton試劑的高100倍以上,從而建立水楊基熒光酮 (SAF)-CoⅡ-H2O2熒光法測定羥自由基的新體系,其激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為510nm和500nm,利用該測定體系在反應(yīng)前后的熒光變化,可間接測定羥自由基產(chǎn)生量。該法不需昂貴的儀器設(shè)備,方法靈敏,操作簡單易行。清除率實驗及ESR波譜法檢測均證明了該方法的準確可靠,對于醫(yī)用篩選抗羥自由基藥物及抗羥自由基機理研究等方面具有應(yīng)用價值。

4)Ce3+熒光法 徐向榮等[20,21]利用Ce3+在稀硫酸中能產(chǎn)生特征熒光,其最大激發(fā)波長OH和發(fā)射波長分別為280nm和360nm。利用Fenton反應(yīng)或Sn2+與H2O2作用能將Ce3+氧化成無熒光Ce4+,通過測定Ce3+的熒光強度變化可間接測定羥基自由基的產(chǎn)生量。該法儀器簡單,操作簡便,測定快速,適于羥自由基的在線測定和監(jiān)控。

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