孫 賀，劉樂承 （長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州434025）

原生質(zhì)體是除去細(xì)胞壁后得到的微球體［1］。原生質(zhì)體技術(shù)是指在原生質(zhì)體分離基礎(chǔ)上進(jìn)行的一系列技術(shù)操作，主要包括原生質(zhì)體融合、遺傳轉(zhuǎn)化、植株再生等［2］。自從1960年Cocking首次用纖維素酶制備番茄根原生質(zhì)體獲得成功，迄今已有46個(gè)科160多個(gè)屬360多種植物的原生質(zhì)體再生植株問世，80多種科間、屬間、種間或品種間細(xì)胞融合獲得胞質(zhì)種［3-5］。近年來，人們將原生質(zhì)體技術(shù)廣泛應(yīng)用于蔬菜育種工作中，并取得了令人矚目的成果，獲得了甘藍(lán)和白菜［6］、蕃茄［7-8］、油菜［9］、蘿卜［10］等體細(xì)胞雜交植株。

1 原生質(zhì)體植株再生技術(shù)及變異

1．1 原生質(zhì)體植株再生途徑

原生質(zhì)體再生植株的形成有以下途徑［4，11］：細(xì)胞團(tuán)發(fā)育形成愈傷組織，經(jīng)分化形成植株；愈傷組織分化形成胚狀體，再發(fā)育成植株；直接形成胚狀體，再發(fā)育成植株。

1．2 原生質(zhì)體再生植株變異

黃瓜的再生植株多為四倍體或者是多倍體，形態(tài)表現(xiàn)為株型矮小，節(jié)間粗短，葉片深綠、小而厚硬，早花早果［12］。李耿光等［13］發(fā)現(xiàn)馬鈴薯的再生植株葉片出現(xiàn)了披針形、匙形和腫脹現(xiàn)象，葉片表現(xiàn)不一致，莖桿粗細(xì)不均。大白菜的再生植株可以得到二倍體［14］。但是，葉肉原生質(zhì)體再生植株具有正常四倍體的頻率很低，而非整倍體頻率很高，染色體變異明顯。而熊新生［15］發(fā)現(xiàn)在甘藍(lán)原生質(zhì)體再生的無性系中也有高頻率的染色體倍性的變異。

1．3 原生質(zhì)體再生植株變異的原因

再生植株的變異受實(shí)驗(yàn)過程中外界條件的影響比較大。首先，原生質(zhì)體的來源多種多樣，變異類型也因植物種類、品種而異。同時(shí)分離原生質(zhì)體的植物材料本身對(duì)變異的影響也很大，使用無性繁殖的植物更易發(fā)生變異。對(duì)于甘藍(lán)，主要是從子葉、根、葉片、下胚軸等分離出原生質(zhì)體［16］。其次，同一種類的植株采用的原生質(zhì)體來源不同，再生植株的變異也各不相同。再次，各個(gè)培養(yǎng)條件是經(jīng)過研究探索發(fā)現(xiàn)的，這種人工創(chuàng)造的條件無法與真正的細(xì)胞環(huán)境條件相比。而外源激素對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響也比較顯著，其他影響因素也不容忽略。

2 原生質(zhì)體融合和細(xì)胞雜交技術(shù)在蔬菜育種中的應(yīng)用

原生質(zhì)體融合就是2種異源原生質(zhì)體，在誘導(dǎo)劑的誘發(fā)下相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合，再經(jīng)過細(xì)胞壁再生形成雜種細(xì)胞的過程［17］。細(xì)胞雜交包括體細(xì)胞雜交、不對(duì)稱細(xì)胞雜交、體細(xì)胞和性細(xì)胞雜交和微細(xì)胞雜交。不對(duì)稱細(xì)胞雜交產(chǎn)生具有1個(gè)親本的細(xì)胞核和2個(gè)親本的細(xì)胞質(zhì)的體細(xì)胞雜種［4］，可以克服有性雜交不親和以及增加育種工作中變異［18］。

2．1 獲取并轉(zhuǎn)移外源遺傳物質(zhì)，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化

原生質(zhì)體是進(jìn)行非載體遺傳操作的良好受體，可以直接攝取外源物質(zhì)，包括細(xì)胞核、細(xì)胞器基因組、DNA片斷及病毒顆粒，直接進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，是進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化研究的理想工具。Mukhopadhyay等［19］報(bào)道，甘藍(lán)下胚軸原生質(zhì)體在PEG的介導(dǎo)下，直接攝取抗潮霉素的標(biāo)記基因的質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化頻率10%～30%，而且獲得了轉(zhuǎn)化再生植株。由此可見，細(xì)胞質(zhì)融合技術(shù)明顯優(yōu)于有性雜交是因?yàn)榭梢詫?duì)細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行遺傳操作，從而引起各種細(xì)胞器的重組。體細(xì)胞雜交創(chuàng)造變異的潛力很大，能夠豐富種質(zhì)資源，保持和促進(jìn)生物多樣性。

2．2 原生質(zhì)體融合獲得胞質(zhì)雜種

胞質(zhì)雜種可以通過以下3種途徑產(chǎn)生：1個(gè)正常的原生質(zhì)體與1個(gè)去核的原生質(zhì)體融合；1個(gè)正常的原生質(zhì)體與1個(gè)核失活的原生質(zhì)體融合；融合以后的某一階段1個(gè)親本的核或者染色體被排除［4］。

體細(xì)胞雜種綜合了雙親的全部性狀，雙親所有的遺傳物質(zhì)都會(huì)影響雜種后代的表現(xiàn)，所以對(duì)體細(xì)胞雜交后代的改良也是一個(gè)艱巨的工程，而胞質(zhì)雜種有望減輕這一工程的工作量，可能會(huì)解決對(duì)稱融合倍性增加和優(yōu)劣性狀均進(jìn)入雜種的問題［20］。另外，非對(duì)稱雜交時(shí)，受體親本多倍化可以緩沖外來基因組產(chǎn)生的某些負(fù)效應(yīng)［21］；進(jìn)行對(duì)稱雜交時(shí)，親本的倍性高可能會(huì)造成基因組間不協(xié)調(diào)、重組復(fù)雜等，給選擇有用雜種后代增加難度，因此對(duì)稱體細(xì)胞雜交常與花藥培養(yǎng)相結(jié)合，來進(jìn)行優(yōu)良基因的組合［22］。若對(duì)野生親本先進(jìn)行花藥培養(yǎng)再進(jìn)行體細(xì)胞雜交，會(huì)使體細(xì)胞雜種在形態(tài)上更接近栽培親本，有利于得到利用價(jià)值高的體細(xì)胞雜種［23］。

2．3 實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)源遺傳重組，創(chuàng)造新的育種材料，培育新品種

原生質(zhì)體融合在一定程度上克服雜交育種中諸如不親和性、性器官敗育障礙等，獲得雜種，但親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，獲得遺傳上穩(wěn)定的雜種難度越大［24］。在甘藍(lán)育種中，種間的和屬間的雜種為甘藍(lán)品種改良提供了豐富的變異類型［25］。Schenck等［26］首次獲得了甘藍(lán)與白菜的體細(xì)胞雜種。白菜型油菜與甘藍(lán)進(jìn)行體細(xì)胞雜交得到了合成種［4］。番茄與類番茄進(jìn)行種間雜交得了體細(xì)胞雜種［27］。Horita等［28］得到了百合屬體細(xì)胞雜交的后代。通過體細(xì)胞雜交也可以提高植株的抗逆性。李省印等［29］新育出的 “優(yōu)生1號(hào)”平菇品系，經(jīng)栽培試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其適應(yīng)性強(qiáng)、優(yōu)質(zhì)、豐產(chǎn)、抗雜、耐熱。一些野生種中，有許多抗蟲、抗病、抗旱、耐鹽堿、抗高溫等優(yōu)良性狀，將栽培植物與野生種作為親本，經(jīng)過原生質(zhì)體融合、選擇與再生，從而獲得野生種的抗逆特性。

3 存在問題與展望

原生質(zhì)體技術(shù)本身也還存在一些問題，首先原生質(zhì)體植株再生的難易會(huì)直接影響體細(xì)胞雜交育種的成敗。其次，誘導(dǎo)融合過程中的許多因素會(huì)直接影響到原生質(zhì)體的活力、融合率，使得誘導(dǎo)物質(zhì)的使用、融合方法的選擇顯得很重要，所以應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行提高融合頻率的研究，尤其是電融合技術(shù)在原生質(zhì)體融合中的應(yīng)用研究更要加強(qiáng)［30］。再次，體細(xì)胞雜種或胞質(zhì)雜種本身染色體數(shù)目不確定，而且染色體結(jié)構(gòu)易發(fā)生變異，以及存在異常的減數(shù)分裂等，造成培養(yǎng)過程中出現(xiàn)不穩(wěn)定的問題。此外，體細(xì)胞雜交育種同樣存在雜種不育或育性差的問題。

當(dāng)某一性狀的遺傳基礎(chǔ)不明確或存在多基因或胞質(zhì)基因控制的情況下，進(jìn)行有關(guān)基因的轉(zhuǎn)移是目前利用基因工程手段還無法實(shí)現(xiàn)的，而體細(xì)胞雜交則能實(shí)現(xiàn)這類基因的轉(zhuǎn)移［31］。原生質(zhì)體技術(shù)的應(yīng)用不僅僅培育了一批優(yōu)良品種，更催生了一大批先進(jìn)實(shí)用的研究成果和技術(shù)。在大力推廣常規(guī)脫毒和快繁技術(shù)的同時(shí)，加快發(fā)展植物快繁生物反應(yīng)器，將為種苗業(yè)帶來新的變革。應(yīng)用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)植物來源的生物產(chǎn)品，盡管目前僅在少數(shù)植物上實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)，但隨著植物細(xì)胞工程生物反應(yīng)器技術(shù)的完善，其應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⑦M(jìn)一步擴(kuò)大。

原生質(zhì)體技術(shù)在種質(zhì)創(chuàng)新和品質(zhì)改良上顯示了巨大潛力，并不意味著它可以完全取代常規(guī)育種技術(shù)。正如社會(huì)發(fā)展到今天，紙張依然無法取代一樣。所以原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交技術(shù)與遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)相輔相成，與常規(guī)育種技術(shù)結(jié)合起來，將為植物基因組之間的結(jié)合和相互作用以及新品種的培育提供無限的可能性［11］。

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