周賢用 傅紅興 劉云西 李 慧 徐 逸 朱靚靚溫州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，浙江 溫州 325035

隨著糖尿病患者在中國的日益增多，糖尿病的治療研究也成為了醫(yī)藥工作者的一個(gè)重要研究方向。糖尿病動(dòng)物模型的制備對(duì)糖尿病的治療研究非常重要，而Beagle犬因體積大、體質(zhì)強(qiáng)，其糖尿病癥狀表現(xiàn)與人相似，是糖尿病治療研究中重要的動(dòng)物模型。

本研究采用文獻(xiàn)報(bào)道的鏈脲佐菌素（STZ）和四氧嘧啶（Alloxan）聯(lián)合進(jìn)行血管內(nèi)給藥[1-2]，較好的獲得了糖尿病Beagle犬模型，但實(shí)驗(yàn)犬最終因長時(shí)間不進(jìn)食而死亡。本研究對(duì)此例Beagle犬糖尿病的造模經(jīng)過和結(jié)果進(jìn)行闡述和分析，以供大家建模參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

Beagle犬，♂，體重15 kg，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 材料

鏈脲佐菌素（Sigma，美國）；四氧嘧啶（Sigma，美國）；檸檬酸（蘇州工業(yè)園區(qū)東方化工廠）；檸檬酸三鈉（蘇州工業(yè)園區(qū)東方化工廠）；低精蛋白鋅胰島素注射液（江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司）；生理鹽水（市售）。

1.3 儀器

血糖儀及血糖試紙（德國POLYGREEN，博士醫(yī)生血糖監(jiān)測(cè)系統(tǒng)）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 藥物溶液的配制[1-2]0.1 mol/L檸檬酸緩沖液的配制：稱取檸檬酸2.1 g加入雙蒸水100 mL中配成A液；稱取檸檬酸三鈉2.94 g加入雙蒸水100 mL中配成B液；用時(shí)將A、B液按一定比例（1︰1.32）混合，即是所需配置STZ的檸檬酸緩沖液（pH=4.5）。

稱取STZ 1.2 g，加至10 mL檸檬酸緩沖液中，攪拌溶解即得120 mg/mL鏈脲佐菌素溶液。稱取Alloxan 2 g，加至10 mL檸檬酸緩沖液中，攪拌溶解即得200 mg/mL的四氧嘧啶溶液。

1.4.2 造模步驟 Beagle犬造模前先穩(wěn)定飼養(yǎng)1周，每天記錄犬的進(jìn)食量、攝水量、活動(dòng)狀況。造模前禁食24 h，前臂靜脈采血測(cè)正常情況下空腹血糖值。稱重，先背部皮下注射阿托品（0.05 mg/kg），注射20～30 min后再行陸眠寧注射，等犬完全麻醉后，右前肢剃毛、消毒；麻醉下行股靜脈穿刺，留置導(dǎo)管，經(jīng)導(dǎo)管分別注入上述濃度的四氧嘧啶（50 mg/kg）和鏈脲霉素（30 mg/kg）溶液，在密封式靜脈留置針上靜脈滴注葡糖糖/生理鹽水。

1.4.3 血糖測(cè)定及飼養(yǎng)護(hù)理 在藥物誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后定時(shí)取靜脈血測(cè)定血糖值，分別在第1、8、10、13 h經(jīng)皮下注射50%的葡萄糖溶液5～10 mL；以后分別在第20、24、48小時(shí)及第7、14天采血做同樣測(cè)定；24 h后開始給予胰島素，初始劑量為2 U/d，并根據(jù)血糖的變化確定胰島素的用量。定期稱重及必要時(shí)進(jìn)行血液生化和血常規(guī)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 給藥后犬的反應(yīng)

Beagle犬經(jīng)靜脈注射藥物1 h后開始有嘔吐反應(yīng)，此時(shí)測(cè)血糖顯示“LOW”，及時(shí)靜脈推注50%葡萄糖注射液5 mL；犬在24 h內(nèi)多次嘔吐，狀態(tài)低迷，至第26小時(shí)時(shí)突然全身劇烈抽搐，呈暈厥狀，及時(shí)送寵物醫(yī)院搶救（懷疑為酸中毒，及時(shí)用保肝、保胃和碳酸氫鈉中和酮癥酸等治療）后緩解。第3日犬恢復(fù)飲食，但進(jìn)食的1周內(nèi)也有多次嘔吐，小便失禁，血糖和尿糖均較高；至第14日開始犬幾乎未進(jìn)食了，每天用葡萄糖/生理鹽水維持，必要時(shí)2～3 d給予一次靜脈滴注脂肪乳100 mL；但治療期間連喝水都吐，直至第26日死亡。

2.2 血糖的變化

給藥前后Beagle狗的血糖變化如下圖1。糖尿病模型成模標(biāo)準(zhǔn)[3]：四氧嘧啶、鏈脲霉素聯(lián)合給藥后24 h血糖升高，48 h以后血糖＞11.1 mmol/L，且持續(xù)2周維持在此高血糖水平。本Beagle犬的血糖變化基本符合高血糖要求，但由于其進(jìn)食不規(guī)律，血糖波動(dòng)較大。

圖1 造模前后血糖變化情況

2.3 體重的變化

給藥后Beagle犬體重持續(xù)下降，見圖2。雖在第6日由于恢復(fù)飲食后體重略有回升，但最終趨勢(shì)還是持續(xù)下降。

圖2 造模前后體重變化情況

2.4 其他糖尿病評(píng)價(jià)指標(biāo)

給藥后Beagle犬出現(xiàn)多飲、多尿、尿糖陽性、消瘦無力等癥狀，與糖尿病患者發(fā)病體征較吻合。第19日血液生化規(guī)檢查結(jié)果顯示血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）277 U，淀粉酶（AMY）560 U，顯示有明顯肝損和胰腺損傷，血清白蛋白（ALB）33.0，顯示營養(yǎng)不良。

Beagle犬于造模第26日凌晨死亡，經(jīng)尸檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其胰腺外膜有較多的出血點(diǎn)，膽囊壞死（見圖3、4），其他由于長期未進(jìn)食，胃黏膜和腸黏膜也有多處充血和血絲。

圖3 胰腺膨大，有多處出血點(diǎn)

圖4 膽囊壞死，有較多膽汁蓄積

3 討論

STZ和Alloxan因體內(nèi)半衰期較短，且溶液中不穩(wěn)定，宜現(xiàn)配現(xiàn)用，且要求快速注射。四氧嘧啶最好在冰浴上避光操作，并在配完后30 min內(nèi)用完。

建模后犬最危險(xiǎn)的時(shí)間是在給藥后24 h內(nèi)，血糖的劇烈波動(dòng)和藥物對(duì)器官的急性損傷極易導(dǎo)致動(dòng)物的低血糖或高酮癥酸中毒死亡。

本實(shí)驗(yàn)雖參考文獻(xiàn)[1-2]的給藥劑量，但在造模過程中對(duì)犬顯示了較大的毒性，可能文獻(xiàn)是30年前的劑量，至今由于藥品質(zhì)量的改進(jìn)或犬的個(gè)體差異導(dǎo)致犬在短期內(nèi)死亡。因此建議建該模型時(shí)可考慮采用小劑量多次給藥，對(duì)動(dòng)物機(jī)體的損傷可能較小。

[1]Black HE, Rosenblum IY，Charles CC.Chemically induced（streptozotocinalloxan） diabetes mellitus in the dog biochemical and ultrastructural studies[J].AM J Path, 1980, 98(2):295-305.

[2]劉晟，王維，羅賢明，等.藥物誘導(dǎo)狗I型糖尿病的研究[J].湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，25（2）：125-128.

[3]陳道瑾，黃建華，孫維佳，等. 狗全胰切除制作實(shí)驗(yàn)性糖尿病模型[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，1992，9（1）：30-31.