吳 旋 白東清 朱國霞 寧 博

隨著水產(chǎn)動物養(yǎng)殖規(guī)模地不斷擴(kuò)大,水產(chǎn)品產(chǎn)量逐年上漲,人們對水產(chǎn)品品質(zhì)提出了更高的要求[1]。但是水產(chǎn)動物疾病頻發(fā),是制約水產(chǎn)品品質(zhì)提高的瓶頸。因此,尋求一種高效、環(huán)保、低毒副作用的藥物,已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。而中草藥多糖在此方面發(fā)揮了獨(dú)到的功效,為解決該難題做出了巨大的貢獻(xiàn)。

黃芪多糖(Astraglus polysaccharides,APS)是從黃芪中提取的天然活性成分[2],具有抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)機(jī)體體液免疫、激活免疫細(xì)胞因子等功效,目前黃芪多糖作為免疫增強(qiáng)劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中已見報(bào)道[3-7],但其在黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)上的研究及應(yīng)用尚未見報(bào)道。基于此,本研究以我國的淡水經(jīng)濟(jì)魚類——黃顙魚作為試驗(yàn)對象,在魚飼料中分別添加不同水平的黃芪多糖,旨在探討長期連續(xù)投喂黃芪多糖對黃顙魚頭腎巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性與外周血白細(xì)胞增殖能力的影響,為尋求提高黃顙魚非特異性免疫力的藥物開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)魚與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

540尾 2齡健康黃顙魚取自天津農(nóng)學(xué)院漁場,體重(61.6 ±5.4)g、體長(19.5±3.2)cm,隨機(jī)分成 6組,每組 3個重復(fù),每個重復(fù) 30尾魚。分別投喂添加 0、300、600、900、1 200、1 500 mg/kg黃芪多糖的飼料,飼養(yǎng)期為 8周。試驗(yàn)魚飼養(yǎng)于架設(shè)在養(yǎng)殖池中的 1.5 m×1.5 m×1 m的 18個網(wǎng)箱中,每箱隨機(jī)投放黃顙魚 30尾(雌雄各占 1/2)。試驗(yàn)期間水溫保持在(26±2)℃,每天連續(xù)充氧,試驗(yàn)期間每天換水 1/3左右。日投餌率為 2%,每天投喂 3次。基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平見表 1。

1.1.2 試劑

L-15培養(yǎng)基、脂多糖 (lipopolysaccharide,LPS)、Hanks溶液、佛波豆寇乙酸脂(phobolmyr-istate acetate,PMA)、硝基藍(lán)四氮唑(nitroblue tetrazolium,NBT)、肝素鈉、超氧化物歧化酶標(biāo)準(zhǔn)品和噻唑蘭(thiazolyl blue,MTT)購自 Sigma公司;胎牛血清購自 Gibco公司;鏈霉素 -青霉素購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。硅石 -聚乙烯吡咯烷酮(phytohaemagglutinin,Percoll)、細(xì)胞培養(yǎng)板購自 Pharmacia公司;格里斯氏(Griesse)試劑購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.2 方法

1.2.1 黃顙魚頭腎巨噬細(xì)胞與外周血白細(xì)胞的分離

每組取 6尾魚,使用 MS-222麻醉后,采用Bayne[8]的方法分離黃顙魚頭腎巨噬細(xì)胞,使用Percoll密度梯度法[9]分離頭腎巨噬細(xì)胞,并使用臺盼藍(lán)進(jìn)行細(xì)胞活性檢測并計(jì)數(shù),以確?；罴?xì)胞的數(shù)量大于 90%,調(diào)整細(xì)胞密度為 1.0×107個/mL,27℃培養(yǎng)備用。在無菌的條件下進(jìn)行尾靜脈采血,外周血白細(xì)胞的分離方法與頭腎巨噬細(xì)胞的相同。

1.2.2 免疫細(xì)胞活性指標(biāo)檢測

頭腎巨噬細(xì)胞氧呼吸爆發(fā)(oxygen respiratory burst,ORB)活性的測定采用 NBT法[10]。以添加0 APS組采集的細(xì)胞液為空白對照,在細(xì)胞液中添加 LPS(500μg/mL)為陽性對照,其他各 APS組采集的細(xì)胞液分別為 1個處理,每個處理設(shè) 7個重復(fù)。使用酶聯(lián)免疫檢測儀,在 620 nm下,測定吸光度(OD)值。

頭腎巨噬細(xì)胞氮呼吸爆發(fā)(nitrogen respiratory burst,NRB)活性的測定采用 Griesse試劑法[11],其他操作同氧呼吸爆發(fā)活力的測定。在 540 nm下測定 OD值。

外周血白細(xì)胞的增殖采用 MTT比色法檢測[12],每個處理細(xì)胞設(shè) 12個重復(fù),培養(yǎng) 24 h后,在 570 nm的波長下測定 OD值,記錄結(jié)果。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,采用 SPSS 17.0軟件包中的單因素方差分析(one-way ANOVA),以 P＜0.01和 P＜0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 黃芪多糖對黃顙魚頭腎巨噬細(xì)胞氧呼吸爆發(fā)活性的影響

由圖 1和表 2可知,與空白對照相比,陽性對照頭腎巨噬細(xì)胞氧呼吸爆發(fā)活性極顯著提高(P＜0.01),這說明試驗(yàn)中培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)良好;除300 mg/kg黃芪多糖組頭腎巨噬細(xì)胞氧呼吸爆發(fā)活性低于空白對照外,其余各組黃顙魚氧呼吸爆發(fā)活性隨黃芪多糖添加水平的增加而增加,但僅在1 200 mg/kg組氧呼吸爆發(fā)活性顯著高于空白對照(P＜0.05)。由此得出,黃芪多糖的添加水平可顯著影響頭腎巨噬細(xì)胞氧呼吸爆發(fā)活性,且1 200 mg/kg黃芪多糖添加水平最適宜。

2.2 黃芪多糖對黃顙魚頭腎巨噬細(xì)胞氮呼吸爆發(fā)活性的影響

由圖 2和表 2可知,與巨噬細(xì)胞氧呼吸爆發(fā)活性相似,與空白對照相比,陽性對照氮呼吸爆發(fā)活性極顯著提高(P＜0.01);添加黃芪多糖后,變化趨勢也與氮呼吸爆發(fā)活性變化相似,并在 1 200和1 500 mg/kg組氮呼吸爆發(fā)活性極顯著高于空白對照(P＜0.01),但 2組間差異不顯著 (P＞0.05)。因此從提高黃顙魚頭腎巨噬細(xì)胞氮呼吸爆發(fā)活性的角度考慮,飼料中黃芪多糖的適宜添加量為 1 200 mg/kg。

圖1 黃芪多糖對黃顙魚頭腎巨噬細(xì)胞氧呼吸爆發(fā)活性的影響Fig.1 Effects of Astragalus polysaccharides on oxygen respiratory burst activity of head-kidney macrophages of yellow catfish

圖2 黃芪多糖對黃顙魚頭腎巨噬細(xì)胞氮呼吸爆發(fā)活性的影響Fig.2 Effects of Astragalus polysaccharides on nitrogen respiratory burst activity of head-kidney macrophages of yellow catfish

2.3 黃芪多糖對黃顙魚外周血白細(xì)胞增殖的影響

由圖 3和表 2可知,各水平黃芪多糖組均能有效地提高黃顙魚外周血白細(xì)胞的增殖能力(P＜0.05),且 1 200和 1 500 mg/kg組外周血白細(xì)胞增殖能力比空白對照分別提高了 39.98%與35.97%(P＜0.01),其中 1200 mg/kg水平組增殖效果最好。因此從外周血白細(xì)胞增殖能力提高的角度上分析,選擇 1 200 mg/kg黃芪多糖水平較適宜。

表2 黃芪多糖對黃顙魚頭腎巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)活力及外周血白細(xì)胞增值能力的影響Table 2 Effects of Astragalus polysaccharides on respiratory burst activity of head-kidney macrophages and proliferation of peripheral blood leukocyte of yellow catfish

圖3 黃芪多糖對黃顙魚外周血白細(xì)胞增殖能力的影響Fig.3 Effects of Astragalus polysaccharides on proliferation of peripheral blood leukocytes of yellow catfish

3 討 論

3.1 黃芪多糖對動物細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性的影響

在黃芪多糖提高動物機(jī)體免疫功能方面,國內(nèi)外學(xué)者已進(jìn)行了大量研究。Yina等[3]和 Yin等[4]發(fā)現(xiàn),對鯉魚投喂含 0.5%的黃芪多糖飼料,在第 2、5周時能顯著提高頭腎巨噬細(xì)胞的氧呼吸爆發(fā)活性,而黃芪多糖與脂多糖混合后對鯉魚頭腎巨噬細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),能顯著地提高頭腎巨噬細(xì)胞的氮呼吸爆發(fā)活性;László等[5]曾報(bào)道,使用含 0.1%黃芪多糖提取物的飼料投喂尼羅羅非魚,并對其中性粒細(xì)胞的氧呼吸爆發(fā)活性進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示1～4周黃芪多糖組的呼吸爆發(fā)活性均高于對照組;曹麗萍等[6]使用黃芪多糖對鯉魚巨噬細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能顯著提高其氮呼吸爆發(fā)活性;Lee等[13]研究發(fā)現(xiàn),黃芪多糖能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的一氧化氮的產(chǎn)量,并能增強(qiáng)一氧化氮合酶的表達(dá);邱妍等[14]使用黃芪多糖對雞脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),多糖濃度在100μg/mL時,對其一氧化氮含量的增加具有較好的促進(jìn)作用,而且存在量效關(guān)系。

本試驗(yàn)結(jié)果表明,黃芪多糖添加在飼料中投喂黃顙魚,在適宜的添加范圍內(nèi)能夠有效地提高該魚頭腎巨噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)活性,表明飼料中添加適宜水平黃芪多糖可以有效提高魚機(jī)體免疫細(xì)胞的活性,增強(qiáng)機(jī)體免疫力。而這一結(jié)果恰好與上述的研究結(jié)論相印證。

3.2 黃芪多糖對動物白細(xì)胞增殖活性的影響

在魚類的自身免疫系統(tǒng)中巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞與各種粒細(xì)胞起著抵抗和殺滅病原菌,保護(hù)機(jī)體的重要作用。因此白細(xì)胞的增殖能力也成為考量一種免疫增強(qiáng)劑是否有效的重要指標(biāo)。關(guān)于黃芪多糖可以提高白細(xì)胞的增殖能力已經(jīng)得到了廣泛的證實(shí):曹麗萍等[6]研究發(fā)現(xiàn),黃芪多糖能顯著增強(qiáng)鯉魚外周血白細(xì)胞的增殖能力;黃玉章等[7]使用不同添加量的黃芪多糖飼料投喂羅非魚,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比,各試驗(yàn)組羅非魚腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量均高于對照組;章世元等[15]等使用黃芪多糖與苜蓿多糖對肉仔雞的外周血淋巴與脾臟淋巴細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),得出結(jié)論黃芪多糖具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的作用,在添加量為100μg/mL時效果最佳;王國秀等[16]通過試驗(yàn)得出,黃芪多糖本身或協(xié)同刀豆蛋白 A(ConA)或 LPS均能增強(qiáng)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力;張訓(xùn)海等[17]指出,黃芪多糖能促進(jìn)雞脾淋巴細(xì)胞的增殖,且濃度為300 mg/L時效果最佳。這些研究成果均與本試驗(yàn)中得出的黃芪多糖能顯著提高黃顙魚外周血白細(xì)胞的增殖,且與添加水平有關(guān)的結(jié)論相一致。

4 結(jié) 論

①連續(xù) 8周投喂適宜水平的黃芪多糖能有效地促進(jìn)黃顙魚頭腎巨噬細(xì)胞的氧、氮呼吸爆發(fā)活性與外周血白細(xì)胞的增殖能力。

②黃芪多糖的添加量在 1 200 mg/kg時的作用效果最佳。

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