杜建文 孫海洲＊ 趙存發(fā) 李勝利 宋麗霞

尿素是動物機體蛋白質代謝的主要終產物,它一直被認為是以脂質擴散的形式進行跨膜運動的。然而,隨著研究的深入,人們發(fā)現在紅細胞和腎集合管末段對尿素的通透率遠高于簡單脂質擴散,于是廣大研究者推斷存在一種控制尿素轉運的載體——尿素轉運蛋白 (urea transporter,UT)[1-3],隨后證明尿素跨膜轉運是由載體蛋白調控的[4]。1993年,You等[5]首次從兔腎臟內髓質層分離得到尿素轉運蛋白 -A2(UT-A2)的cDNA,為研究 UT奠定了基礎,從而也對傳統(tǒng)的尿素轉運機制提出了挑戰(zhàn)。隨后,Olives等[6]從人骨髓中分離出了另一個 UT家族成員——尿素轉運蛋白 -B(UT-B)的 cDNA。隨著研究的深入,人們已從大量的動物中發(fā)現了 UT的存在,尤其是山羊消化系統(tǒng)、肝臟和唾液腺[7],牛瘤胃[8-9]以及綿羊消化系統(tǒng)[10]。眾所周知,反芻動物飼糧氮的利用率很低,一般認為其通過大量的內源氮循環(huán)(其中大部分以尿素的形式進行循環(huán))來提高氮的利用。研究發(fā)現,飼糧可以調控內源氮循環(huán)[7-10],而已有研究表明 UT對尿素循環(huán)起著極其重要的作用[1-5]。本研究擬通過蛋白質印跡(Western Blot)來測定飼糧中玉米的加工方式和蛋白質水平對內蒙古白絨山羊消化系統(tǒng) UT-B的相對表達量,旨在研究飼糧結構對山羊消化系統(tǒng) UT-B表達的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選用 18只體況良好、平均體重為(34.95±2.37)kg的裝有永久性瘤胃瘺管的內蒙古白絨山羊半同胞羯羊,隨機分為 6組,每組 3個重復,每個重復 1只,單欄飼養(yǎng)。

1.2 試驗飼糧和試驗設計

試驗飼糧參照 NRC(2007)山羊營養(yǎng)需求配制。試驗用玉米分為破碎(C)和膨化(E)2種,試驗飼糧蛋白質含量分為低(L)、中(M)、高(H)3個水平。6組試驗飼糧分別為破碎玉米低蛋白質(CL)組、破碎玉米中蛋白質(CM)組、破碎玉米高蛋白質(CH)組、膨化玉米低蛋白質(EL)組、膨化玉米中蛋白質(EM)組和膨化玉米高蛋白質(EH)組。CM組為對照組,代謝能為維持代謝能的 1.4倍。試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表 1。

試驗羊每天分別在 06:30和 18:30先粗后精等量飼喂,自由飲水,飼喂 45 d后每組選取 1只屠宰采樣。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis) %

1.3 樣品采集

試驗羊宰前禁食 24 h,禁水 12 h,取腮腺、瘤胃背囊和腹囊、網胃、瓣胃、皺胃、十二指腸(近端)、回腸、盲腸盲囊和盲腸(回盲結合部后 30 cm處)、肝臟、腎臟,用冷生理鹽水沖洗。瘤胃黏液層要從肌層剝離,腸道要把漿膜和肌膜從黏膜上剝離,樣品進行編號(表 2)后 -80℃保存待測。

表2 各組試驗羊樣品編號Table 2 The number of the samples in various organs of the goats in each group

1.4 兔抗羊多克隆抗體的制備和樣品中 UT-B的測定

多克隆抗體制備參照 Ludden等[10]的方法,免疫用多肽序列為:CEENRIFYLQSTKRTV,根據Smith等[11]描述的山羊 UT-B的 ACP18881序列合成的。

蛋白質印跡檢測各樣品中 UT-B的表達情況,然后將 CL組試驗羊的腮腺目的蛋白(34 ku)條帶的灰度值定義為基礎值(1.000),計算各組織的目的蛋白(34 ku)的相對表達量(目的蛋白條帶的灰度值 /基礎值)。

1.5 數據處理

所有數據用 Excel軟件進行整理。

2 結 果

圖1是所有被測樣品中 UT-B的免疫印跡圖,各試驗羊組織均表達了 34 ku的 UT-B,然而所有檢測的腮腺樣品中均表達了 30、50和 54 ku的UT-B,前胃(瘤胃、網胃和瓣胃)樣品中表達了30 ku的 UT-B,肝臟樣品中表達了 54 ku的 UT-B。此外,一些樣品中還表達了其他分子質量的UT-B,比如 5和 6號(CL組的瓣胃和皺胃)樣品中表達了 40 ku的 UT-B、30號(CH組的瓣胃)樣品中表達了50 ku的 UT-B。研究認為,32～36 ku的UT-B為未糖基化的 UT-B,可調控尿素雙向跨消化道(瘤胃壁)轉運[8],因此本研究僅對 34 ku UT-B的相對表達量進行分析。各組試驗羊消化系統(tǒng)的34 ku UT-B的相對表達量差異性如表 3所示。相對定量分析結果:組間比較發(fā)現,CL組 34 ku UT-B的相對表達量最高,EM組次之,CM組最低;組織間比較發(fā)現,34 ku UT-B的相對表達量以肝臟最高,次之為皺胃、網胃、瘤胃背囊、腹囊、腮腺、瓣胃,隨后是十二直腸、盲腸、盲腸盲囊、回腸,腎臟最低。

3 討 論

UT-B是哺乳動物體內存在的尿素易化轉運的載體,研究認為 UT-B是 Na-依賴性的尿素易化轉運系統(tǒng)。據報道,羔羊的十二指腸、回腸和結腸[11]以及牛的瘤胃腹部[12]均存在 47 ku的UT-B。Marini等[13]研究發(fā)現,羔羊肝臟含有 45 ku的UT-B。Ludden等[10]研究發(fā)現,羊腮腺、瘤胃背腹囊、網胃、小腸、盲腸、結腸、肝臟和腎臟中都含有32和 47 ku的 UT-B,瘤胃、網胃和肝臟中 32 ku的UT-B較多,而在腸道中 47 ku的 UT-B較多,腎臟中 2種分子質量的 UT-B接近,并認為 32 ku為未糖基化的 UT-B,47 ku為 UT-B的 N端糖基化形式,這類似于 Stewartg等[8]應用 RT-PCR技術推斷出牛瘤胃 UT-B為 43～54 ku,利用尤斯灌流室技術發(fā)現 UT-B調控尿素雙向跨瘤胃壁轉運,并發(fā)現36 ku為未糖基化的 UT-B。 Simmons等[9]研究飼喂青貯基礎飼糧和精料基礎飼糧的利木贊雜交肉牛發(fā)現,飼喂精料基礎飼糧的肉牛瘤胃 UT-B mRNA含量顯著增加,表明 UT-B可以調節(jié)氮代謝平衡。本研究所測樣品中 UT-B基本在 30～54 ku且各組織均含有 34 ku的 UT-B,其他分子質量的UT-B的表達與否因飼糧和組織不同呈現差異。

表3 各組試驗羊消化系統(tǒng) 34 ku UT-B的相對表達量Table 3 The relative expression quantity of 34 ku UT-B in digestive system of the goats in each group

研究表明,飼喂低蛋白質飼糧會增加反芻動物消化道對尿素的通透性[9,13-14]。一般認為,低蛋白質飼糧可以促進動物消化道及其他組織中UT的表達。Inoue等[12]研究發(fā)現,低蛋白質飼糧促進大鼠腎臟 UT-B的表達,低蛋白質飼糧使大鼠結腸 UT-B表達稍有降低,高蛋白質飼糧則變化不顯著。飼喂高蛋白質飼糧的奶牛瘤胃背囊乳頭中UT-B表達增強[14],這與本研究結果相同。本研究還發(fā)現,瘤胃腹囊、網胃、瓣胃、回腸、盲腸盲囊以及腎臟中的 34 ku UT-B的相對表達量隨著飼糧蛋白質水平增加而增加。本研究中,飼糧結構對腮腺 UT-B表達的影響最小,皺胃最大;飼糧高蛋白質水平可促進前胃、回腸、盲腸及盲囊和腎臟中34 ku UT-B的表達,對十二直腸起抑制作用,對腮腺、皺胃和肝臟的影響較小,玉米膨化加工只降低了34 ku UT-B在回腸和肝臟的表達;從組織層次看,34 ku UT-B相對表達量最高為肝臟,次之為皺胃、網胃、瘤胃、腮腺、瓣胃,隨后為腸道組織,腎臟最低。因此,可以認為飼糧結構可調控 34 ku UT-B在山羊消化系統(tǒng)中的表達。

4 結 論

在綜合考慮飼糧蛋白質水平和碳水化合物的形式對內蒙古白絨山羊瘤胃內環(huán)境的影響的情況下,通過改變飼糧結構可以調控山羊消化系統(tǒng)各組織中的 UT-B的表達,為進一步研究尿素循環(huán)和機體氮代謝提供依據。

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