張 偉 楊震國(guó) 侯永清 丁斌鷹 朱惠玲 劉玉蘭 王 蕾

腸黏膜是機(jī)體抵御病原菌和毒素的天然屏障,在細(xì)菌、病毒或內(nèi)毒素等應(yīng)激狀態(tài)下,機(jī)體對(duì)能量的需求大量增長(zhǎng),導(dǎo)致大量自由基產(chǎn)生,自由基使核酸和蛋白質(zhì)氧化,并通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)損傷生物膜,破壞了腸黏膜的完整性及功能[1-2]。因此,通過(guò)營(yíng)養(yǎng)調(diào)控途徑改善動(dòng)物腸道黏膜的抗氧化能力、提高生產(chǎn)性能變得意義巨大。現(xiàn)已證實(shí)谷胱甘肽(GSH)在機(jī)體生物抗氧化體系中發(fā)揮重要作用,它通過(guò)清除自由基維持細(xì)胞正常的結(jié)構(gòu)和功能,保護(hù)組織免受氧化損傷,但外源性 GSH不能進(jìn)入完整細(xì)胞內(nèi),它的胞內(nèi)合成需要外源供給 GSH的前體物質(zhì)[3]。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)為硫醇類化合物,是天然氨基酸 L-半胱氨酸與 GSH的前體[4],NAC作為小分子物質(zhì),易于進(jìn)入細(xì)胞,脫乙?；蟪蔀?GSH合成的前體,促進(jìn) GSH的合成。體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn) NAC能提高小鼠紅細(xì)胞、肝組織和肺組織中細(xì)胞內(nèi)的GSH水平[5],增強(qiáng)組織的抗自由基能力。另外,NAC作為 L-半胱氨酸的乙?；衔?其含有活躍的—SH,具有干擾自由基生成,調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝等活性作用,在呼吸、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)方面的疾病及艾滋病的臨床和試驗(yàn)研究中均有廣泛應(yīng)用[6]。NAC對(duì)豬的抗氧化作用仍鮮有報(bào)道。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分之一,進(jìn)入體內(nèi)可導(dǎo)致大量自由基產(chǎn)生[7],常作為模擬應(yīng)激的經(jīng)典模型。由此,本試驗(yàn)旨在通過(guò)對(duì)仔豬多次腹膜注射 LPS建立慢性免疫應(yīng)激模型,研究 NAC對(duì)豬空腸黏膜抗氧化能力的影響,探討 NAC緩解 LPS應(yīng)激導(dǎo)致生長(zhǎng)抑制的機(jī)理,為 NAC的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

NAC:市售醫(yī)藥級(jí)產(chǎn)品,純度≥99.0%。LPS:大腸桿菌血清型 055∶B5,SIGMA公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取 18頭健康的(35±2)日齡仔豬[杜洛克 ×長(zhǎng)白 ×大白,平均體重(11.58±0.26)kg],隨機(jī)分成 3個(gè)組(對(duì)照組、LPS組、NAC組 ),每組6個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù) 1頭豬。預(yù)試期 3 d,正試期20 d。對(duì)照組和 LPS組飼喂基礎(chǔ)飼糧,NAC組飼喂基礎(chǔ)飼糧 +0.05%NAC,在試驗(yàn)第 10天、第 13天和第 20天清晨,LPS組和 NAC組仔豬按100μg/kg BW的量腹膜注射 LPS,對(duì)照組注射相應(yīng)劑量的滅菌生理鹽水。第 21天清晨,即最后1次注射 LPS 24 h后,全部仔豬注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg BW),待完全麻醉后屠宰,取空腸黏膜,待測(cè)。

1.3 飼糧組成與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)基礎(chǔ)飼糧為玉米 -豆粕型飼糧,參照NRC(1998)10～20 kg豬的營(yíng)養(yǎng)需要配制,其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表 1。

試驗(yàn)期間豬舍保持溫度為 22～25℃。試驗(yàn)豬在不銹鋼代謝籠中單體飼養(yǎng),鴨嘴式飲水器自動(dòng)供水,自由采食,定時(shí)清掃和消毒豬舍。

1.4 樣品采集

豬屠宰后剖開(kāi)腹腔,于空腸 1/2處截取長(zhǎng)約10 cm的腸段,用冰凍的生理鹽水清洗后,在冰盤上用玻片迅速刮取黏膜,然后轉(zhuǎn)至盛有液氮的研缽中研成粉末,分裝。迅速轉(zhuǎn)移至 -80℃冰箱凍存。

1.5 測(cè)定指標(biāo)與方法

空腸黏膜氧化相關(guān)酶活性測(cè)定,包括超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮合酶(NOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS);空腸黏膜氧化相關(guān)產(chǎn)物的含量測(cè)定,包括丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(O-2)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、還原型谷胱甘肽(GSH)。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet(air-dry basis) %

其中,O2-含量參考譚亞男等[8]的方法,其他指標(biāo)均采用試劑盒測(cè)定。GSSG和 GSH試劑盒購(gòu)買于碧云天生物技術(shù)研究所,其含量采用二硫代二硝基苯甲酸法測(cè)定,步驟詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。其余試劑盒購(gòu)買于南京建成生物工程研究所,SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定,CAT活性采用紫外分光法測(cè)定,GSH-Px活性采用二硫代二硝基苯甲酸法測(cè)定,NOS和 iNOS活性采用 NOS催化 L-Arg比色法測(cè)定,MDA含量采用硫代巴比妥酸(TAB)法測(cè)定,H2O2含量采用鉬酸絡(luò)合物比色法測(cè)定,具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素方差分析(One-way ANOVA)和 Duncan氏法多重比較,以 P＜0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn),結(jié)果用平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

2.1 空腸黏膜氧化相關(guān)酶活性

由表 2可知,與對(duì)照組相比,LPS組的 SOD和CAT活性分別降低了 16.03%(P＜0.01)和47.52%(P＜0.01),NOS和 iNOS活性分別提高了21.95%(P＜0.05)和 30.00%(P＜0.01);與 LPS組相比,NAC組的 CAT活性提高了 35.61%(P＜0.05),iNOS活性降低了 18.68%(P＜0.01);與對(duì)照組相比,NAC組的 CAT活性降低了 28.83%(P＜0.01),其他指標(biāo)差異不顯著 (P＞0.05)。GSH-Px活性各組差異不顯著(P＞0.05)。

2.2 空腸黏膜氧化相關(guān)產(chǎn)物的含量

由表 3可知,與對(duì)照組相比,LPS組的 MDA、H2O2、O-2含量和 GSSG/GSH分別提高了 27.81%(P＜0.05)、15.36%(P＜0.05)、89.15%(P＜0.01)和 130.69%(P＜0.01);與 LPS組相比,NAC組的 MDA、H2O2、O-2含量和 GSSG/GSH分別降低了 24.06%(P＜0.05)、11.75(P＜0.05)、32.34%(P＜0.01)和 54.08%(P＜0.01);與對(duì)照組相比,NAC組的 O-2含量升高了 27.98%(P＜0.01),其他指標(biāo)差異不顯著(P＞0.05)。

表2 飼糧添加NAC對(duì) LPS刺激仔豬空腸黏膜氧化相關(guān)酶的影響Table 2 Effects of dietary NAC on oxidation-relevant enzymes in jejunal mucosa of LPS-challenged piglets

表3 飼糧添加 NAC對(duì)LPS刺激仔豬空腸黏膜氧化相關(guān)產(chǎn)物的影響Table 3 Effects of dietary NAC on oxidation-relevant products in jejunal mucosa of LPS-challenged piglets

3 討 論

3.1 NAC對(duì)LPS刺激仔豬空腸黏膜氧化相關(guān)酶的影響

本試驗(yàn)中,LPS刺激導(dǎo)致仔豬空腸黏膜 SOD和CAT活性的降低,說(shuō)明 LPS多次刺激導(dǎo)致空腸黏膜SOD和 CAT被大量消耗,空腸黏膜抗氧化酶系統(tǒng)受到損害,而在 LPS刺激仔豬飼糧中添加 NAC后,SOD和 CAT活性升高,說(shuō)明 NAC有助于維持抗氧化酶系統(tǒng)的平衡,緩解 LPS應(yīng)激導(dǎo)致的氧化應(yīng)激。作者推測(cè) NAC可能通過(guò)抑制 NADPH氧化酶活性,導(dǎo)致質(zhì)膜 NADPH氧化酶從 NAD(P)H傳遞電子給O2的能力降低,使得 O-2生成受阻,減少了抗氧化酶 SOD和 CAT的消耗,從而緩解了 LPS導(dǎo)致的氧化應(yīng)激。Sridharan等[12]研究發(fā)現(xiàn),NAC連續(xù) 1周胃內(nèi)預(yù)處理給藥,可以增加大鼠體內(nèi) SOD、CAT的活性,與本試驗(yàn)結(jié)果類似。

一氧化氮(NO)作為一種信使或介質(zhì),它既有利于機(jī)體的自身免疫防御能力,又具有潛在的毒性,而 NO的作用和信使功能主要受 NOS調(diào)控[13]。NOS分為固有型(cNOS)和誘導(dǎo)型(iNOS),iNOS在腸黏膜中含量豐富,在缺氧或內(nèi)毒素刺激后迅速被活化[14]。腸黏膜受到應(yīng)激后 iNOS由非激活狀態(tài)迅速活化,產(chǎn)生大量的 NO,高濃度的 NO容易與體內(nèi) O-2形成氧化性更強(qiáng)的 ONOO-,后者可誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化損傷[15]。

本試驗(yàn)中,LPS刺激使空腸黏膜 NOS和 iNOS活性升高,添加 NAC后 iNOS活性顯著降低。這證實(shí) LPS刺激可以促進(jìn) NOS和 iNOS的活化,進(jìn)而可能引起 NO大量生成,對(duì)腸黏膜組織產(chǎn)生毒害作用,導(dǎo)致氧化損傷。NAC對(duì)腸黏膜氧化損傷的緩解作用可能由于 NAC抑制了 LPS刺激誘導(dǎo)的 iNOS表達(dá),具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。與此類似,巫國(guó)誼等[16]也研究發(fā)現(xiàn),NAC能降低肝臟 iNOS活性,改善急性肝損傷。

3.2 NAC對(duì) LPS刺激仔豬空腸黏膜氧化相關(guān)產(chǎn)物的影響

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的一種重要分解產(chǎn)物,可以間接反映機(jī)體組織氧化損傷的程度[17]。而自由基主要有 O-2自由基、羥自由基、H2O2等,這些自由基是機(jī)體氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的有害化合物,具有強(qiáng)氧化性,它們的含量高低反映了組織自由基的積累程度[18]。GSSG是 GSH的氧化形式,在氧化劑作用下 GSH通過(guò) GSH-Px氧化成 GSSG,而 GSSG通過(guò) NADPH供氫,在谷胱甘肽還原酶的作用下又還原成 GSH,二者構(gòu)成一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡,使 GSSG維持在總 GSH量的 1%～10%[19],構(gòu)成有效的抗氧化系統(tǒng),故可用來(lái)評(píng)估脂質(zhì)過(guò)氧化損傷情況[20]。

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),LPS多次刺激導(dǎo)致仔豬空腸黏膜 MDA、H2O2、O-2含量增多,GSSG/GSH上升,飼糧中添加 NAC后均降低,表明 LPS刺激使腸黏膜自由基或氧化產(chǎn)物增多,導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化,而NAC能降低自由基等有害產(chǎn)物的積累,調(diào)節(jié)氧化與還原產(chǎn)物的比率,抑制 LPS對(duì)腸黏膜的損害。NAC的作用可能是因?yàn)?NAC為細(xì)胞內(nèi)提供—SH來(lái)源,而活性—SH具有較強(qiáng)的還原能力,對(duì)體內(nèi)自由基具有明顯的拮抗作用;另外,NAC能將細(xì)胞外的胱氨酸還原為半胱氨酸,并可在腸黏膜細(xì)胞中轉(zhuǎn)化成GSH,進(jìn)而通過(guò) GSH發(fā)揮抗氧化作用,清除體內(nèi)的自由基。田新強(qiáng)等[21]發(fā)現(xiàn),LPS導(dǎo)致小鼠肝臟 GSH含量顯著降低,MDA含量顯著升高,而飼糧中添加NAC能顯著改善這種情況;劉平洋[22]研究發(fā)現(xiàn)飼糧中添加 GSH可顯著降低小腸黏膜 MDA含量,改善仔豬腸道的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷;喬小蓉等[23]在人血清中加入 NAC表明,GSH/GSSG顯著升高。這些都與本試驗(yàn)結(jié)果類似。

抗氧化酶與氧化相關(guān)產(chǎn)物之間存在著緊密的聯(lián)系,如 SOD能促進(jìn) O-2分解成 O2和 H2O2,而 H2O2又能在 GSH-Px和 CAT的作用下分解成無(wú)毒害的H2O和 O2。GSSG和 GSH能在 GSH-Px的調(diào)解下相互轉(zhuǎn)化,它們之間存在典型的氧化/抗氧化的動(dòng)態(tài)平衡,這可能是飼糧中添加 NAC同時(shí)影響氧化相關(guān)酶活性與產(chǎn)物的原因。

有研究表明,通過(guò)不同途徑改善機(jī)體的抗氧化能力,可以提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能[24]。胡堯等[25]也通過(guò)對(duì)仔豬血液中抗氧化指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明,飼糧添加 NAC可增強(qiáng)仔豬機(jī)體抗氧化能力,進(jìn)而緩解 LPS刺激導(dǎo)致的生長(zhǎng)抑制。本次試驗(yàn)中仔豬空腸黏膜中抗氧化指標(biāo)的結(jié)果也說(shuō)明,飼糧添加 NAC可增強(qiáng)仔豬機(jī)體抗氧化能力,進(jìn)而緩解 LPS刺激導(dǎo)致的生長(zhǎng)抑制。

4 結(jié) 論

①LPS多次刺激使仔豬腸道氧化酶激活,抑制抗氧化酶的活性,導(dǎo)致有害自由基產(chǎn)生和氧化產(chǎn)物增多。

②飼糧中添加 0.05%NAC能有效緩解 LPS刺激引起的負(fù)面影響,提高腸黏膜的抗氧化能力,并可能通過(guò)此途徑緩解 LPS刺激引起的生長(zhǎng)抑制。

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