景丹龍，王玉兵，梁宏偉，王靜，張德春

（1.三峽大學(xué)生物技術(shù)研究中心，湖北 宜昌 443002；2.神農(nóng)架國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局生物多樣性保護(hù)研究實(shí)驗(yàn)室，湖北 木魚 442400）

水杉（Metasequoia glyptostroboides）屬杉科水杉屬，落葉喬木，素有“活化石”之稱，是世界上珍稀的孑遺植物。主要分布在湖北、四川、湖南三省交界的利川、石柱、龍山等局限地區(qū)。水杉樹形優(yōu)美，生長快，是亞熱帶地區(qū)平原綠化的優(yōu)良樹種，也是速生用材樹種；在古植物學(xué)、古氣候?qū)W、古地理和地質(zhì)學(xué)，以及裸子植物系統(tǒng)發(fā)育的研究中均有重要意義[1]。

同工酶是生物體內(nèi)的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)不同而能催化同一反應(yīng)的酶，廣泛應(yīng)用于生物進(jìn)化、遺傳學(xué)、生理學(xué)等研究。作為遺傳基因的標(biāo)記植物，它對(duì)植物的生理生化及新陳代謝方面的研究具有重要意義。目前，對(duì)水杉的研究主要集中在其地理分布、系統(tǒng)演化地位、群落生態(tài)學(xué)以及遺傳多樣性等方面[2-3]，由于水杉種子天然發(fā)芽率低，種子向幼苗的轉(zhuǎn)型率低，自然更新困難，加上人為破壞等原因，致使野生水杉數(shù)量急劇下降而處于瀕危狀態(tài)[4]。筆者針對(duì)水杉種子萌發(fā)困難的突出問題，通過對(duì)水杉種子在光暗交替與全黑暗下萌發(fā)過程中的同工酶進(jìn)行分析，旨在探索水杉種子萌發(fā)的分子機(jī)理，進(jìn)而為挽救瀕危植物水杉提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水杉種子采自2010年10月湖北省利川。在水杉種子發(fā)芽率試驗(yàn)中，分別取光暗交替（光照12 h/d）和全黑暗條件下，發(fā)芽過程中不同萌發(fā)時(shí)間（1～6 d）的水杉種子，每天取樣1次，每次5份，每份0.5 g，液氮處理后，放入-70℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酶液制備酶液的提取:分別取-70℃下保存的材料0.5 g，加入PVP 0.1 g，磷酸緩沖液2.5 mL（pH值為7.8，使用時(shí)需預(yù)冷），冰浴研磨成勻漿，12000 r/min，4℃離心20 min，取上清液，離心3次，即為酶提取液，用于同工酶分析。

1.2.2 電泳和染色同工酶電泳采用不連續(xù)垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠制備參照何忠效等[5]的方法。分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為3%，膠厚1.5 mm，每槽加樣40 U（酶提取液∶40%甘油∶10%溴酚藍(lán)=30∶10∶1），電極緩沖液為Tris-甘氨酸溶液（pH值為8.3），初始電流強(qiáng)度為20 mA，后增加至30 mA；4℃下，電泳4～5 h后，進(jìn)行酯酶（EST）、淀粉酶（AMY）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、ATP酶（ATPase）同工酶等5種同工酶的染色。

EST同工酶采用醋酸萘酯-堅(jiān)牢藍(lán)RR鹽染色法[6]；AMY同工酶采用淀粉-醋酸-碘染色法[5]；SOD同工酶參照何忠效等[5]介紹的NBT光還原法；POD同工酶采用醋酸-聯(lián)苯胺染色方法[5]；ATPase同工酶采用Tris-甘氨酸緩沖-ATP-氯化鈣染色法[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 水杉種子萌發(fā)過程中的酯酶（EST）同工酶酶譜的變化

從圖1可知，電泳的負(fù)極到正極依次為A1～A13，共13條酶帶。其中，A1、A2是各時(shí)期的共有酶帶。水杉種子在光暗交替條件下萌發(fā)時(shí)，第3天的EST同工酶酶帶數(shù)明顯增多，第4天達(dá)到最多；而黑暗條件下萌發(fā)的種子酶帶數(shù)在第4天才開始增多，第6天達(dá)到最多。從整體看，光暗交替條件進(jìn)行萌發(fā)的水杉種子的酶帶數(shù)和含量要明顯優(yōu)于全黑暗。

圖1 水杉種子不同光照條件萌發(fā)過程中EST電泳圖譜

2.2 水杉種子萌發(fā)過程中的過氧化物酶（POD）同工酶酶譜的變化

水杉種子萌發(fā)過程中的過氧化物酶（POD）同工酶酶譜變化如圖2所示，共有5條酶帶，從負(fù)極到正極依次為A1～A5，其中A1、A2、A3、A5是各時(shí)期的共有酶帶。A4在光暗交替條件下第3天出現(xiàn)，接著消失，第6天又重新出現(xiàn)；而A4在全黑暗條件下第4天才出現(xiàn)，消失后第6天又重新出現(xiàn)。由于A4在兩種萌發(fā)條件下的表達(dá)差異明顯，所以A4是調(diào)控水杉種子萌發(fā)的非常重要的酶。

圖2 水杉種子不同光照條件萌發(fā)過程中POD電泳圖譜

2.3 水杉種子萌發(fā)過程中的淀粉酶（AMY）同工酶酶譜的變化

水杉種子萌發(fā)過程中的淀粉酶（AMY）同工酶酶譜的變化如圖3所示，從負(fù)極到正極依次為A1-A3，一共3條酶帶，其中A1、A3是其各時(shí)期的共有酶帶，A2在光暗交替條件下第2天出現(xiàn)，而在黑暗條件下第1天出現(xiàn)。但從圖中可以看出，水杉種子在光暗交替條件下的AMY同工酶含量高于黑暗條件下，說明光暗交替條件下的水杉種子能在萌發(fā)過程中提供更多的能量。

圖3 水杉種子不同光照條件萌發(fā)過程中AMY電泳圖譜

2.4 水杉種子萌發(fā)過程中的超氧化物歧化酶（SOD）同工酶酶譜的變化

水杉種子萌發(fā)過程中的超氧化物歧化酶（SOD）同工酶酶譜的變化如圖4所示，從負(fù)極到正極依次為A1～A4，一共4條酶帶，其中A1、A4為各時(shí)期的共有酶帶。水杉種子在光暗交替條件下，A2在第1天出現(xiàn)，A3在第3天出現(xiàn)，而在黑暗條件下，A2在第3天出現(xiàn)，A3在5天出現(xiàn)。這說明光暗交替條件下的水杉種子在清除有害代謝產(chǎn)物方面優(yōu)于全黑暗條件下。

圖4 水杉種子不同光照條件萌發(fā)過程中SOD電泳圖譜

2.5 水杉種子萌發(fā)過程中的ATP酶（ATPase）同工酶酶譜的變化

水杉種子萌發(fā)過程中的ATP酶同工酶酶譜的變化如圖5所示，一共6條，從負(fù)極到正極依次為A1～A6，其中A1、A2、A3、A4為各時(shí)期的共有酶帶。A5、A6在光暗交替條件下第1天出現(xiàn)，而在全黑暗條件下第5天出現(xiàn)。從整體看，光暗交替條件進(jìn)行萌發(fā)的水杉種子各時(shí)期ATPase同工酶含量要明顯優(yōu)于全黑暗所對(duì)應(yīng)的各時(shí)期。

圖5 水杉種子不同光照條件萌發(fā)過程中ATP電泳圖譜

3 討論

光照是植物生長發(fā)育過程中不可缺少的環(huán)境因子。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，光暗交替條件下進(jìn)行萌發(fā)的水杉種子的EST、AMY、SOD、POD、ATPase同工酶明顯優(yōu)于全黑暗條件下萌發(fā)的水杉種子。種子發(fā)芽能力直接影響了植物在森林演替中的地位，一般認(rèn)為光照強(qiáng)度是先鋒植物種類在林下發(fā)展的主要限制因子。朱小龍等[8]在研究光照條件對(duì)長苞鐵杉種子萌發(fā)影響時(shí)，也發(fā)現(xiàn)50%全日照條件下，種子萌發(fā)率和幼苗存活率最高。

SOD和POD為細(xì)胞氧化還原系統(tǒng)的組成酶，能通過有效地清除細(xì)胞內(nèi)過量的活性氧、自由基，維持胞內(nèi)活性氧水平的平衡[9]。水杉種子在光暗交替條件下的SOD和POD同工酶含量明顯高于全黑暗條件下，說明水杉種子在光暗交替條件下，能夠及時(shí)清除細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的自由氧基和有害物質(zhì)，從而減少活性氧對(duì)植物體的危害，更利于水杉種子的萌發(fā)。AMY和ATPase同工酶能為細(xì)胞代謝活動(dòng)及時(shí)提供能量[10-11]，而本試驗(yàn)中光暗交替條件下水杉種子的AMY和ATPase同工酶含量也明顯高于全黑暗處理的種子。

從同工酶水平分析可知，光暗交替條件比全黑暗條件更利于水杉種子的萌發(fā)。由于自然條件下，水杉種子的空癟率較高，萌發(fā)率較低，因此如何更好的結(jié)合其他因素提高水杉種子的萌發(fā)率，成為下階段的研究重點(diǎn)之一。

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