安 倩 張萍萍 李明浩 陳于和 吳麗芳

1(河北科技師范學(xué)院 秦皇島 063000)

2(中國科學(xué)院離子束生物工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 合肥 230031)

據(jù)美國能源部和世界能源理事會(huì)預(yù)測(cè)，全球石化類能源的可開采年限分別為石油 39年、天然氣60年、煤211年[1,2]，到21世紀(jì)中葉化石燃料將被開采殆盡，或因開采成本過高而失去開采價(jià)值。為應(yīng)對(duì)世界范圍的能源危機(jī)，開發(fā)和利用可再生新能源成為各國的戰(zhàn)略舉措。其中，生物能源備受關(guān)注。

國外研究較多的生物柴油木本植物是麻風(fēng)樹，但其只適合生長(zhǎng)于我國少數(shù)地區(qū)[3,4]。黃連木(Pistacia chinensis Bunge)又稱楷木、藥木、黃連茶等，屬漆樹科(Family anacardiaceae)黃連木屬(Pistacia chinensis)，是多年生木本油料植物。黃連木的特點(diǎn)為：

(1) 用途廣泛，可用作生產(chǎn)肥皂、潤(rùn)滑油、染料粘合劑、工程塑料等的工業(yè)原料；

(2)分布范圍廣，野生和栽培于華北、華南及華中23個(gè)省區(qū)；

(3) 適應(yīng)性強(qiáng)，耐干旱、鹽堿、瘠薄，可在荒山荒地種植，宜于大面積造林；

(4)含油率高，果實(shí)含油率～35%、果肉含油率～50%、種子含油率42%、種仁含油率56%[5]。以黃連木種子為原料生產(chǎn)的生物柴油，主要理化指標(biāo)達(dá)美國生物燃料油標(biāo)準(zhǔn)和中國輕質(zhì)燃料油標(biāo)準(zhǔn)S6T[6]。黃連木是我國極具開發(fā)前景的生物質(zhì)液體燃料樹種，屬優(yōu)先發(fā)展的木本能源樹種之一[7–10]。

黃連木油脂轉(zhuǎn)化生物柴油技術(shù)，是我國唯一通過國家鑒定[國經(jīng)貿(mào)鑒字(2002)046號(hào)]的木本生物質(zhì)柴油生產(chǎn)技術(shù)。然而，大規(guī)模開發(fā)利用取決于種質(zhì)資源，要獲得高產(chǎn)、高品質(zhì)、童期短、抗病蟲的黃連木種子，關(guān)鍵在育種。常規(guī)育種技術(shù)是通過基因重組、累加、互補(bǔ)等遺傳效應(yīng)獲得新類型，既保持原品種的優(yōu)良性狀，又弱化原品種的不良性狀。其整體水平提高幅度大，但有遺傳穩(wěn)定性差、育種周期長(zhǎng)的缺點(diǎn)。輻射誘變育種是繼實(shí)生選種和雜交育種后發(fā)展的育種方法，可大大提高基因突變頻率，縮短育種周期，改良品質(zhì)而又不改變?cè)贩N的優(yōu)質(zhì)性狀，可獲得常規(guī)育種難以奏效的新種質(zhì)[11]。

目前，黃連木多處于野生狀態(tài)，基礎(chǔ)研究較為薄弱，且大多集中于引種栽培、播種繁殖、病蟲害防治、資源調(diào)查等方面。用輻射手段獲得黃連木新種質(zhì)，加快黃連木遺傳改良的步伐，此類研究尚未見報(bào)道。本文將黃連木種子進(jìn)行不同劑量的鈷60g射線輻照，由萌發(fā)率、苗高、成苗率、形態(tài)及RAPD分析法研究處理植株的變異，獲得的初步結(jié)果，可為輻射法獲取黃連木優(yōu)良種質(zhì)提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 黃連木種子及其輻照

黃連木種子干種子取自安徽省東至山區(qū)。在安徽省農(nóng)科院原子能所進(jìn)行60Co g射線輻照，劑量率為 14Gy/min，劑量分別為 100、200、400、600、800Gy，以未輻照種子作對(duì)照。

1.2 種子萌發(fā)

輻照處理種子及對(duì)照種子用70%乙醇處理1.25 min，用0.1%氯化汞處理15 min，無菌水沖洗后置于墊有 Φ9cm 培養(yǎng)皿中(墊有三層濾紙)，加入 12 mL蒸餾水。每組100粒，重復(fù)3次。加蓋后25°C恒溫黑暗培養(yǎng)。種子以胚根明顯露白為發(fā)芽，統(tǒng)計(jì)第3、7、10天發(fā)芽種子數(shù)[12]。14天后，將幼苗轉(zhuǎn)移到裝有營(yíng)養(yǎng)土的盆缽中培養(yǎng) 6周左右后移栽大田，移栽前測(cè)量并記錄苗高。6個(gè)月后，統(tǒng)計(jì)成苗率，觀察并統(tǒng)計(jì)植株變異情況（此時(shí)可觀察到穩(wěn)定的植株變異性狀）。

1.3 基因組DNA提取

主要試劑：CTAB提取緩沖液：3% CTAB(CTAB購自Bio Basic INC)，100 mmol/L Tris-HCl(Tris購自Bio Basic INC)，50 mmol/L EDTA（國藥試劑），1.4 mol/L NaCl，3%b-巰基乙醇，3% PVP，pH=8.0；氯仿-異戊醇(24:1)；5 mol/L KAc，RNA酶（上海生工）10 mg/mL。

用于DNA提取的樣品取自6個(gè)月以上的植株，在每個(gè)處理劑量與對(duì)照組中隨機(jī)取12個(gè)植株，取幼嫩葉片提取DNA?；蚪MDNA的提取用CTAB法，參考程世平等[13–15]提取方法并稍加改進(jìn)。

1.4 RAPD反應(yīng)

以對(duì)照和不同處理劑量的植株 DNA為模板，用RAPD隨機(jī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)在Applied Biosystems Thermal Cycler上進(jìn)行。采用上海生工S系列引物，從28個(gè)引物中篩選19個(gè)可用引物進(jìn)行RAPD 分析(表 1)。反應(yīng)體系為 20 mL：10′buffer，2.0 mL；200 mmol/L dNTP，0.2 mmol/L 引物，1.0 UTaq酶，模板DNA約40 ng。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C 預(yù)變性 2 min，94°C 變性45 s，36℃退火 1 min，72°C 延伸 2 min，45 個(gè)循環(huán)后，72°C 延伸 5 min，4°C保存[16,17]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)照相分析。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)多次，以多次重復(fù)中穩(wěn)定出現(xiàn)的亮帶作為統(tǒng)計(jì)對(duì)象[18,19]。

表1 RAPD分析引物及其序列Table 1 The sequence of primers used for RAPD analysis

2 結(jié)果

2.1 60Co g射線輻照對(duì)種子萌發(fā)的影響

60Co g射線輻照引起黃連木種子發(fā)芽率的降低較對(duì)照差異很明顯，與劑量負(fù)相關(guān)，即隨劑量增大，發(fā)芽率逐漸降低(圖1)。

2.2 60Co g射線輻照生物學(xué)效應(yīng)分析

輻射劑量對(duì)成苗率的影響見表 2，成苗率隨輻射劑量升高而降低。100Gy和200Gy劑量處理的植株成苗率分別為23.75%、20%，而對(duì)照組成苗率為 30%，差異顯著；400、600、800Gy劑量處理的植株成苗率分別為1.75%、0.25%、0，彼此間差異不顯著，但與對(duì)照差異顯著。

圖1 鈷60g射線輻照黃連木種子萌發(fā)的影響Fig.1 Effect of 60Co g-ray irradiation on germination of Pistacia chinensis Bunge seeds.

表2 60Co g射線輻照黃連木種子對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響Table 2 Effect of 60Co g-ray irradiation on seedling growth of Pistacia chinensis Bunge seeds

輻照200和400 Gy的種子的7日發(fā)芽率分別為33%和 32%，幾乎相同，但成苗率分別為 20%和1.75%，差異極顯著。輻照600和 800Gy種子的10日發(fā)芽率在20%左右，但成苗率幾乎為零。生長(zhǎng)速率也隨劑量增大而減小。在7天時(shí)，對(duì)照小苗平均根長(zhǎng)3cm左右，而800Gy小苗平均根長(zhǎng)僅1cm左右（結(jié)果未顯示）。輻射損傷對(duì)苗高的影響(表2)也有同樣趨勢(shì)。100Gy處理組苗高平均為9.2 cm，對(duì)照組為9.7 cm，差異不顯著； 200和400Gy處理組苗高平均為4.0和2.3 cm，與對(duì)照組有顯著差異。

與對(duì)照相比，各輻照處理組的黃連木幼苗出現(xiàn)矮化、株型不對(duì)稱、葉脈失綠、葉片卷曲、畸形等現(xiàn)象(圖2)。成苗率較高的兩個(gè)處理組在幼苗期出現(xiàn)的變異類型的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3，200Gy組的葉形變異率為48.8%，株型變異率為46.3%，明顯高于100Gy組的33.8%和15.0%，說明200Gy輻照對(duì)黃連木幼苗產(chǎn)生較大影響。對(duì)幼苗突變性狀進(jìn)行的跟蹤觀察發(fā)現(xiàn)，幼苗期出現(xiàn)的有些變異性狀很可能是一種短期的生理效應(yīng)，2個(gè)月后大部分變異性狀開始消失。但仍有少數(shù)變異保持到6個(gè)月后(圖3)，這樣的變異應(yīng)是可遺傳的。為此，對(duì)6個(gè)月大的處理材料作了RAPD 分析，以研究其DNA水平的變異。

圖2 60Co g射線輻照后黃連木幼苗變異(A)左，對(duì)照；右，處理后的矮化幼苗 (B,C) 葉形變異幼苗 (D)對(duì)照 (E, F) 株型變異幼苗Fig 2 Seedling variation of Pistacia chinensis Bunge seeds irradiated by 60Co g-rays.(A) the control in the left and the dwarfed plant in the right, (B,C) the leaf variation, (D) the control, (E,F) the type variation

表3 鈷60g射線輻照黃連木種子對(duì)幼苗變異的影響Table3 Effect of 60Co g-ray irradiation on seedling variation of Pistacia chinensis Bunge seeds.

圖3 六個(gè)月植株變異情況(G)株高對(duì)照，(H)和(I)處理后的矮化植株；(J)葉形和株型對(duì)照，(K)和(L)葉形變異，(M)株型變異Fig 3 Variations of the 6-month plants.(G) the control, (H,I), the dwarfed plant; (J) the control, (K,L) the leaf variation, (M) the type variations

2.3 黃連木基因組DNA提取

黃連木葉片富含單寧等次生代謝物質(zhì)，造成DNA提取困難。我們改進(jìn)了DNA提取方法，獲得了純度較高且較為完整的大分子DNA(圖4)。

2.4 RAPD結(jié)果

在所使用的28個(gè)引物中，有19條引物有擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增條帶數(shù)從0-10條不等。與對(duì)照組(未發(fā)現(xiàn)差異)相比，輻照組有條帶的增加或缺失，且差異出現(xiàn)的頻率與劑量有關(guān)：100Gy組有 5株檢測(cè)到RAPD差異，每株變異情況不完全一樣，共記錄到20個(gè)條帶增加，16個(gè)條帶缺失，植株變異率為41.7%，條帶變異率為2.23%；200Gy組有7株檢測(cè)到RAPD差異，其中條帶增加43條次，缺失32條次，植株變異率為58.3%，RAPD條帶變異率為4.63%(見表4)。圖5和圖6是用RAPD引物S17和S82擴(kuò)增出的RAPD條帶差異。

圖4 黃連木基因組DNA提取結(jié)果(M: lDNAHindIII)Fig4 Extraction results of genome DNA of Pistacia chinensis Bunge (M: lDNAHindIII).

表4 鈷60g射線輻照與RAPD條帶變異率的關(guān)系Table4 RAPD fragment bands variation of the 6-month plants grown from the seeds irradiated to 100 and 200 Gy.

圖5 引物S17擴(kuò)增結(jié)果M：marker-G；1–3為對(duì)照，5–9為200Gy劑量處理6和7中各出現(xiàn)一條不見于對(duì)照的條帶(箭頭所示)Fig 5 RAPD bands patterns of S17.M: marker-G; No.1–3, the controls, No.5–9, 200Gy treatment.No.6 and.7 have a band which does not appear in the controls,as indicated by the arrows.

圖6 引物S82擴(kuò)增結(jié)果M, marker-G；1–3, 對(duì)照;4–10, 100Gy 9和10中均缺失一條對(duì)照有的條帶(箭頭所示)Fig 6 RAPD bands patterns of S82.M, marker-G; No.1–3, control; No.4–10, 100 Gy treatment.A band in the control is not found in No.9 and 10, as indicated by the arrow.

3 討論

輻射育種一般采用半致死劑量輻照后種子發(fā)芽率為50%的劑量作為適宜劑量。其他可采用的指標(biāo)還包括種子發(fā)芽率、植株成活率、生長(zhǎng)抑制程度等。本研究的對(duì)照及各輻照處理組的發(fā)芽率和成苗率均未達(dá)到50%，顯然不能用半致死劑量。育種者也常以半致矮量(輻照后植株生長(zhǎng)受抑制的程度)作為誘變劑量是否適宜的標(biāo)準(zhǔn)[20]。本實(shí)驗(yàn)中，200 Gy就可使黃連木幼苗高度降低到對(duì)照的一半，也即半致矮劑量接近200 Gy。況且，200 Gy組100 Gy組能得到更多的株型和葉形變異，也比400 Gy組有更高的成苗率。因此，200Gy是較合適的誘變劑量。這一點(diǎn)在RAPD分析中也得到證實(shí)，200 Gy組的植株變異率及條帶變異率都明顯高于100 Gy。有研究表明，小油桐種子的最佳輻照劑量為132–198 Gy[21]，而毛竹種子為 100–175 Gy[22]，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論相近。

黃連木種子外被蠟質(zhì)，屬深度休眠類型，不能直接發(fā)芽，須經(jīng)過100天左右的低溫(4oC)濕（砂）藏處理才能萌發(fā)。我們?cè)谠囼?yàn)中發(fā)現(xiàn)，去除種殼可打破黃連木種子休眠，故發(fā)芽試驗(yàn)的種子去除種殼。60Co g射線輻照處理后黃連木種子萌發(fā)率隨劑量增加而下降，表明g射線輻照對(duì)種子的生活力有明顯的影響。王兆玉等[21]在研究小油桐種子的60Co g射線輻射效應(yīng)時(shí)，也得到了相似的結(jié)果。

60Co g射線輻照處理的黃連木種子，其成苗率及苗高均低于對(duì)照，且隨輻照劑量增加而減小，600和800Gy組的成苗率幾乎為零。用400Gy以上的輻照處理會(huì)對(duì)黃連木種子造成較嚴(yán)重的損傷，嚴(yán)重影響其發(fā)芽、成苗、生長(zhǎng)，甚至致死。蔡春菊等[22]研究60Co g射線輻射對(duì)毛竹早期幼苗生長(zhǎng)的影響時(shí)，劑量超過100Gy，早期苗高和根生長(zhǎng)受到明顯抑制，抑制作用隨輻照劑量增大，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相似。

用RAPD方法對(duì)植株總DNA進(jìn)行分析，不受表達(dá)產(chǎn)物顯隱性影響，也不像同工酶等易受環(huán)境條件的影響，DNA水平發(fā)生的堿基突變、序列重排、缺失等引起的變異皆可檢測(cè)到。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了60Co g射線輻照導(dǎo)致黃連木在生理生化水平和遺傳水平的變異，且變異率隨劑量增大，200Gy組的誘變效果較為理想。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)60Co g射線輻照得到的突變體，其變異性狀能否穩(wěn)定遺傳，有待進(jìn)一步觀察和鑒定。

1 劉培荃, 楊世誠.植物燃料的研究現(xiàn)狀及其發(fā)展[J].濰坊教育學(xué)院學(xué)報(bào), 1997, 24(2): 37–39 LIU Peiquan, YANG Shicheng.Current status and development of the study on plant fuel [J].Journal of Weifang Educational College, 1997, 24(2): 37–39

2 石培禮, 包維楷.燃料油植物研究的現(xiàn)狀與展望[J].植物雜志, 1994, 5: 2–4 SHI Peili, Bao Weikai.Current status and prospect of the study on fuel-oil plant [J].Plants, 1994, 5: 2–4

3 閔恩澤, 唐忠, 杜澤學(xué), 等.發(fā)展我國生物柴油產(chǎn)業(yè)的探討[J].中國工程科學(xué), 2005, 7(4):1–4 MIN Enze, TANG Zhong, DU Zexue, et al.Perspective of biodiesel industry in China [J].Engineering Science, 2005,7(4):1–4

4 梁坤南.林產(chǎn)化工通訊, 我國熱帶地區(qū)燃料油植物資源的開發(fā)和利用[J].2006, 12:247–252 LIANG Kunnan.Development and utilization of fuel-oil plant resources in tropical regions of China [J].Journal of Chemical Industry of Forest Products, 2006, 12:247–252

5 祝學(xué)范.安徽省生物柴油原料林黃連木的造林技術(shù)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 35 (28):8890–8891 ZHU Xuefan.Study on afforestation technology of biodiesel forest–Pistacia chinensis Bunge in Anhui province [J].Journal of Anhui Agriculture Science, 2007,35 (28):8890–8891

6 王濤.中國主要生物質(zhì)燃料油木本能源植物資源概況與展望[J].科技導(dǎo)報(bào), 2005, 23(5):12–14 WANG Tao.A survey of the woody plant resources for biomass fuel oil in China [J].Science and Technology Review, 2005, 23(5):12–14

7 趙愛紅, 呂敏生, 等.木本燃料油樹種黃連木的播種育苗技術(shù)[J].中國果蔬, 2009, 1:22 ZHAO Aihong, Lü Minsheng, et al.The grin breeding technology of the woody species of fuel oil — Pistacia chinensis Bunge [J].China Fruit and Vegetable, 2009, 1:22

8 秦飛.中國黃連木研究綜述[J].經(jīng)濟(jì)林研究, 2007,25(4): 90–96 QIN Fei.Literature review of researches on Pistacia chinensis Bunge [J].Nonwood Forest Research, 2007,25(4):90–96

9 裴會(huì)明, 陳明琦.黃連木的開發(fā)利用[J].中國野生植物資源, 2005, 24(1):43–44 PEI Huiming, Chen Mingqi.Exploitation and utilization of Pistacia chinnesis Bunge [J].Chinese Wild Plant Resources, 2005, 24(1):43–44

10 侯新村, 牟洪香, 楊士春, 等.木本能源植物黃連木研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 35(12):3524–3525 HOU Xincun, MU Hongxiang, YANG Shichun, et al.Research progress in woody energy plant — Pistacia chinensis Bunge [J].Journal of Anhui Agriculture Science,2007, 35(12):3524–3525

11 楊亞婷.60Co輻射創(chuàng)造柑橘突變體的研究[D].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文, 2009 YANG Yating.Creation of citrus mutant through60Co radiation [D].Master's Degree Dissertation of Huazhong Agricultural University, 2009

12 梁秋霞, 曹剛強(qiáng), 黃群策, 等.超低能離子束注入后番茄的生物學(xué)效應(yīng)[J].激光生物學(xué)報(bào), 2006, 15(4):388–393 LIANG Qiuxia, CAO Gangqiang, HUANG Qunce, et al.The biological effect of tomato by extra–low energy ion–beam irradiation [J].Acta Laser Biology Sinica,2006, 15(4):388–393

13 程世平, 施江, 史國安, 等.黃連木葉片基因組DNA提取方法[J].河南科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 31(3):71–73 CHENG Shiping, SHI Jiang, SHI Guoan.Extraction of genomic DNA in Pistacia chinensis Bunge [J].Journal of Henan University of Science and Technology, 2010,31(3):71–73

14 王軍, 楊傳平, 劉桂豐.木本植物基因組 DNA 提取及鑒定[J].植物研究, 2006, 26(5): 590–594 WANG Jun, YANG Chuanping, LIU Guifeng.Extraction of genomic DNA from woody plants and it's identification [J].Bulletin of Botanical Research, 2006,26(5):590–594

15 Hong L, Walker M A.Extracting DNA from cambium tissue for analysis of grape rootstocks [J].Hort Science,1997, 32(7):1264–1266

16 王超.不同種源黃連木及阿月渾子遺傳多樣性分析[D].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文, 2010 WANG Chao.Genetic diversity of different geographical populations of Pistacia chinensis Bunge and Pistacia vera[D].Master's Degree Dissertation of Agricultural University of Hebei, 2010

17 Prakash Surya, Van Staden Johannes.Sex identification in Encephalartos natalensis (Dyer and Verdoorn) using RAPD markers[J].Euphytica, 2006, 152:197–200

18 Hormaza J I, Dollo L, Polito V S.Identification of a RAPD marker linked to sex determination in Pistacia vera using bulked segregant analysis [J].Theor Appl Genet, 1994, 89:9–13

19 JI Jing, WANG Gang.Molecular markers of nuclear restoration gene Rfl in sunflower using bulked segregant analysis – RAPD [J].Science in China, 1996, 39:551–560

20 辛慶國, 劉錄祥, 郭會(huì)君, 等.7Li離子束注入小麥干種子誘發(fā)M1代變異的SSR分析[J].麥類作物學(xué)報(bào), 2007,27(4):560–564 XIN Qingguo, LIU Luxiang, GUO Huijun, et al.SSR analysis of M1 variation of dry seeds implanted by7Li ion beam in wheat [J].Journal of Triticeae Crops, 2007,27(4):560–564

21 王兆玉, 林敬明, 羅莉, 等.小油桐種子的60Co-g射線輻照敏感性及半致死劑量的研究[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 29(3):506–508 WANG Zhaoyu, LIN Jingming, Luo Li, et al.Sensitivity of Jatropha curcas seeds to60Co-g radiation and their medical lethal doses in radiation breeding [J].J South Med Univ, 2009, 29(3): 506–508

22 蔡春菊, 高健, 牟少華.60Co-g輻射對(duì)毛竹種子活力及期幼苗生長(zhǎng)的影響[J].核農(nóng)學(xué)報(bào), 2007, 21(5):436–440 CAI Chunju, GAO Jian, MU Shaohua.Effects of60Co-gray radiation on seed vigor and young seedling growth of phyllostachys edulis [J].Journal of Nuclear Agricultural Sciences, 2007, 21(5):436–440