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        60Co g射線輻照黃連木的生物學效應

        2011-03-24 05:34:14張萍萍李明浩陳于和吳麗芳
        核技術 2011年7期
        關鍵詞:黃連木成苗條帶

        安 倩 張萍萍 李明浩 陳于和 吳麗芳

        1(河北科技師范學院 秦皇島 063000)

        2(中國科學院離子束生物工程學重點實驗室 合肥 230031)

        據(jù)美國能源部和世界能源理事會預測,全球石化類能源的可開采年限分別為石油 39年、天然氣60年、煤211年[1,2],到21世紀中葉化石燃料將被開采殆盡,或因開采成本過高而失去開采價值。為應對世界范圍的能源危機,開發(fā)和利用可再生新能源成為各國的戰(zhàn)略舉措。其中,生物能源備受關注。

        國外研究較多的生物柴油木本植物是麻風樹,但其只適合生長于我國少數(shù)地區(qū)[3,4]。黃連木(Pistacia chinensis Bunge)又稱楷木、藥木、黃連茶等,屬漆樹科(Family anacardiaceae)黃連木屬(Pistacia chinensis),是多年生木本油料植物。黃連木的特點為:

        (1) 用途廣泛,可用作生產肥皂、潤滑油、染料粘合劑、工程塑料等的工業(yè)原料;

        (2)分布范圍廣,野生和栽培于華北、華南及華中23個省區(qū);

        (3) 適應性強,耐干旱、鹽堿、瘠薄,可在荒山荒地種植,宜于大面積造林;

        (4)含油率高,果實含油率~35%、果肉含油率~50%、種子含油率42%、種仁含油率56%[5]。以黃連木種子為原料生產的生物柴油,主要理化指標達美國生物燃料油標準和中國輕質燃料油標準S6T[6]。黃連木是我國極具開發(fā)前景的生物質液體燃料樹種,屬優(yōu)先發(fā)展的木本能源樹種之一[7–10]。

        黃連木油脂轉化生物柴油技術,是我國唯一通過國家鑒定[國經貿鑒字(2002)046號]的木本生物質柴油生產技術。然而,大規(guī)模開發(fā)利用取決于種質資源,要獲得高產、高品質、童期短、抗病蟲的黃連木種子,關鍵在育種。常規(guī)育種技術是通過基因重組、累加、互補等遺傳效應獲得新類型,既保持原品種的優(yōu)良性狀,又弱化原品種的不良性狀。其整體水平提高幅度大,但有遺傳穩(wěn)定性差、育種周期長的缺點。輻射誘變育種是繼實生選種和雜交育種后發(fā)展的育種方法,可大大提高基因突變頻率,縮短育種周期,改良品質而又不改變原品種的優(yōu)質性狀,可獲得常規(guī)育種難以奏效的新種質[11]。

        目前,黃連木多處于野生狀態(tài),基礎研究較為薄弱,且大多集中于引種栽培、播種繁殖、病蟲害防治、資源調查等方面。用輻射手段獲得黃連木新種質,加快黃連木遺傳改良的步伐,此類研究尚未見報道。本文將黃連木種子進行不同劑量的鈷60g射線輻照,由萌發(fā)率、苗高、成苗率、形態(tài)及RAPD分析法研究處理植株的變異,獲得的初步結果,可為輻射法獲取黃連木優(yōu)良種質提供借鑒。

        1 材料和方法

        1.1 黃連木種子及其輻照

        黃連木種子干種子取自安徽省東至山區(qū)。在安徽省農科院原子能所進行60Co g射線輻照,劑量率為 14Gy/min,劑量分別為 100、200、400、600、800Gy,以未輻照種子作對照。

        1.2 種子萌發(fā)

        輻照處理種子及對照種子用70%乙醇處理1.25 min,用0.1%氯化汞處理15 min,無菌水沖洗后置于墊有 Φ9cm 培養(yǎng)皿中(墊有三層濾紙),加入 12 mL蒸餾水。每組100粒,重復3次。加蓋后25°C恒溫黑暗培養(yǎng)。種子以胚根明顯露白為發(fā)芽,統(tǒng)計第3、7、10天發(fā)芽種子數(shù)[12]。14天后,將幼苗轉移到裝有營養(yǎng)土的盆缽中培養(yǎng) 6周左右后移栽大田,移栽前測量并記錄苗高。6個月后,統(tǒng)計成苗率,觀察并統(tǒng)計植株變異情況(此時可觀察到穩(wěn)定的植株變異性狀)。

        1.3 基因組DNA提取

        主要試劑:CTAB提取緩沖液:3% CTAB(CTAB購自Bio Basic INC),100 mmol/L Tris-HCl(Tris購自Bio Basic INC),50 mmol/L EDTA(國藥試劑),1.4 mol/L NaCl,3%b-巰基乙醇,3% PVP,pH=8.0;氯仿-異戊醇(24:1);5 mol/L KAc,RNA酶(上海生工)10 mg/mL。

        用于DNA提取的樣品取自6個月以上的植株,在每個處理劑量與對照組中隨機取12個植株,取幼嫩葉片提取DNA。基因組DNA的提取用CTAB法,參考程世平等[13–15]提取方法并稍加改進。

        1.4 RAPD反應

        以對照和不同處理劑量的植株 DNA為模板,用RAPD隨機引物進行PCR擴增,反應在Applied Biosystems Thermal Cycler上進行。采用上海生工S系列引物,從28個引物中篩選19個可用引物進行RAPD 分析(表 1)。反應體系為 20 mL:10′buffer,2.0 mL;200 mmol/L dNTP,0.2 mmol/L 引物,1.0 UTaq酶,模板DNA約40 ng。PCR擴增程序為:94°C 預變性 2 min,94°C 變性45 s,36℃退火 1 min,72°C 延伸 2 min,45 個循環(huán)后,72°C 延伸 5 min,4°C保存[16,17]。擴增產物經 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離,凝膠成像系統(tǒng)照相分析。每個反應重復多次,以多次重復中穩(wěn)定出現(xiàn)的亮帶作為統(tǒng)計對象[18,19]。

        表1 RAPD分析引物及其序列Table 1 The sequence of primers used for RAPD analysis

        2 結果

        2.1 60Co g射線輻照對種子萌發(fā)的影響

        60Co g射線輻照引起黃連木種子發(fā)芽率的降低較對照差異很明顯,與劑量負相關,即隨劑量增大,發(fā)芽率逐漸降低(圖1)。

        2.2 60Co g射線輻照生物學效應分析

        輻射劑量對成苗率的影響見表 2,成苗率隨輻射劑量升高而降低。100Gy和200Gy劑量處理的植株成苗率分別為23.75%、20%,而對照組成苗率為 30%,差異顯著;400、600、800Gy劑量處理的植株成苗率分別為1.75%、0.25%、0,彼此間差異不顯著,但與對照差異顯著。

        圖1 鈷60g射線輻照黃連木種子萌發(fā)的影響Fig.1 Effect of 60Co g-ray irradiation on germination of Pistacia chinensis Bunge seeds.

        表2 60Co g射線輻照黃連木種子對幼苗生長的影響Table 2 Effect of 60Co g-ray irradiation on seedling growth of Pistacia chinensis Bunge seeds

        輻照200和400 Gy的種子的7日發(fā)芽率分別為33%和 32%,幾乎相同,但成苗率分別為 20%和1.75%,差異極顯著。輻照600和 800Gy種子的10日發(fā)芽率在20%左右,但成苗率幾乎為零。生長速率也隨劑量增大而減小。在7天時,對照小苗平均根長3cm左右,而800Gy小苗平均根長僅1cm左右(結果未顯示)。輻射損傷對苗高的影響(表2)也有同樣趨勢。100Gy處理組苗高平均為9.2 cm,對照組為9.7 cm,差異不顯著; 200和400Gy處理組苗高平均為4.0和2.3 cm,與對照組有顯著差異。

        與對照相比,各輻照處理組的黃連木幼苗出現(xiàn)矮化、株型不對稱、葉脈失綠、葉片卷曲、畸形等現(xiàn)象(圖2)。成苗率較高的兩個處理組在幼苗期出現(xiàn)的變異類型的統(tǒng)計結果見表3,200Gy組的葉形變異率為48.8%,株型變異率為46.3%,明顯高于100Gy組的33.8%和15.0%,說明200Gy輻照對黃連木幼苗產生較大影響。對幼苗突變性狀進行的跟蹤觀察發(fā)現(xiàn),幼苗期出現(xiàn)的有些變異性狀很可能是一種短期的生理效應,2個月后大部分變異性狀開始消失。但仍有少數(shù)變異保持到6個月后(圖3),這樣的變異應是可遺傳的。為此,對6個月大的處理材料作了RAPD 分析,以研究其DNA水平的變異。

        圖2 60Co g射線輻照后黃連木幼苗變異(A)左,對照;右,處理后的矮化幼苗 (B,C) 葉形變異幼苗 (D)對照 (E, F) 株型變異幼苗Fig 2 Seedling variation of Pistacia chinensis Bunge seeds irradiated by 60Co g-rays.(A) the control in the left and the dwarfed plant in the right, (B,C) the leaf variation, (D) the control, (E,F) the type variation

        表3 鈷60g射線輻照黃連木種子對幼苗變異的影響Table3 Effect of 60Co g-ray irradiation on seedling variation of Pistacia chinensis Bunge seeds.

        圖3 六個月植株變異情況(G)株高對照,(H)和(I)處理后的矮化植株;(J)葉形和株型對照,(K)和(L)葉形變異,(M)株型變異Fig 3 Variations of the 6-month plants.(G) the control, (H,I), the dwarfed plant; (J) the control, (K,L) the leaf variation, (M) the type variations

        2.3 黃連木基因組DNA提取

        黃連木葉片富含單寧等次生代謝物質,造成DNA提取困難。我們改進了DNA提取方法,獲得了純度較高且較為完整的大分子DNA(圖4)。

        2.4 RAPD結果

        在所使用的28個引物中,有19條引物有擴增產物,擴增條帶數(shù)從0-10條不等。與對照組(未發(fā)現(xiàn)差異)相比,輻照組有條帶的增加或缺失,且差異出現(xiàn)的頻率與劑量有關:100Gy組有 5株檢測到RAPD差異,每株變異情況不完全一樣,共記錄到20個條帶增加,16個條帶缺失,植株變異率為41.7%,條帶變異率為2.23%;200Gy組有7株檢測到RAPD差異,其中條帶增加43條次,缺失32條次,植株變異率為58.3%,RAPD條帶變異率為4.63%(見表4)。圖5和圖6是用RAPD引物S17和S82擴增出的RAPD條帶差異。

        圖4 黃連木基因組DNA提取結果(M: lDNAHindIII)Fig4 Extraction results of genome DNA of Pistacia chinensis Bunge (M: lDNAHindIII).

        表4 鈷60g射線輻照與RAPD條帶變異率的關系Table4 RAPD fragment bands variation of the 6-month plants grown from the seeds irradiated to 100 and 200 Gy.

        圖5 引物S17擴增結果M:marker-G;1–3為對照,5–9為200Gy劑量處理6和7中各出現(xiàn)一條不見于對照的條帶(箭頭所示)Fig 5 RAPD bands patterns of S17.M: marker-G; No.1–3, the controls, No.5–9, 200Gy treatment.No.6 and.7 have a band which does not appear in the controls,as indicated by the arrows.

        圖6 引物S82擴增結果M, marker-G;1–3, 對照;4–10, 100Gy 9和10中均缺失一條對照有的條帶(箭頭所示)Fig 6 RAPD bands patterns of S82.M, marker-G; No.1–3, control; No.4–10, 100 Gy treatment.A band in the control is not found in No.9 and 10, as indicated by the arrow.

        3 討論

        輻射育種一般采用半致死劑量輻照后種子發(fā)芽率為50%的劑量作為適宜劑量。其他可采用的指標還包括種子發(fā)芽率、植株成活率、生長抑制程度等。本研究的對照及各輻照處理組的發(fā)芽率和成苗率均未達到50%,顯然不能用半致死劑量。育種者也常以半致矮量(輻照后植株生長受抑制的程度)作為誘變劑量是否適宜的標準[20]。本實驗中,200 Gy就可使黃連木幼苗高度降低到對照的一半,也即半致矮劑量接近200 Gy。況且,200 Gy組100 Gy組能得到更多的株型和葉形變異,也比400 Gy組有更高的成苗率。因此,200Gy是較合適的誘變劑量。這一點在RAPD分析中也得到證實,200 Gy組的植株變異率及條帶變異率都明顯高于100 Gy。有研究表明,小油桐種子的最佳輻照劑量為132–198 Gy[21],而毛竹種子為 100–175 Gy[22],與本實驗的結論相近。

        黃連木種子外被蠟質,屬深度休眠類型,不能直接發(fā)芽,須經過100天左右的低溫(4oC)濕(砂)藏處理才能萌發(fā)。我們在試驗中發(fā)現(xiàn),去除種殼可打破黃連木種子休眠,故發(fā)芽試驗的種子去除種殼。60Co g射線輻照處理后黃連木種子萌發(fā)率隨劑量增加而下降,表明g射線輻照對種子的生活力有明顯的影響。王兆玉等[21]在研究小油桐種子的60Co g射線輻射效應時,也得到了相似的結果。

        60Co g射線輻照處理的黃連木種子,其成苗率及苗高均低于對照,且隨輻照劑量增加而減小,600和800Gy組的成苗率幾乎為零。用400Gy以上的輻照處理會對黃連木種子造成較嚴重的損傷,嚴重影響其發(fā)芽、成苗、生長,甚至致死。蔡春菊等[22]研究60Co g射線輻射對毛竹早期幼苗生長的影響時,劑量超過100Gy,早期苗高和根生長受到明顯抑制,抑制作用隨輻照劑量增大,與本實驗的結果相似。

        用RAPD方法對植株總DNA進行分析,不受表達產物顯隱性影響,也不像同工酶等易受環(huán)境條件的影響,DNA水平發(fā)生的堿基突變、序列重排、缺失等引起的變異皆可檢測到。本實驗結果表明了60Co g射線輻照導致黃連木在生理生化水平和遺傳水平的變異,且變異率隨劑量增大,200Gy組的誘變效果較為理想。本實驗經60Co g射線輻照得到的突變體,其變異性狀能否穩(wěn)定遺傳,有待進一步觀察和鑒定。

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