付 烈,周 穩(wěn),王俊卿,曾一梅,熊 平,汪浩勇

(湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,湖北 武漢 430068)

利用微生物提高石油采收率(MEOR)可以通過多種作用機(jī)理來提高原油開采率,是目前公認(rèn)的開采油藏中剩余油和枯竭油藏最好的廉價(jià)采油方法[1].而當(dāng)前應(yīng)用于MEOR的菌株主要是一些嗜溫菌[2-3],無法在一些高溫油藏的開采中發(fā)揮作用.因此,嗜熱石油降解菌的篩選及降解機(jī)理就逐漸成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn).目前國內(nèi)外已報(bào)道的嗜熱石油降解菌存在著種類少、降解性能不夠理想的問題.本文就新的嗜熱石油降解微生物的篩選及其降解特性進(jìn)行了研究.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)樣品采自湖北省江漢油田王一站地下高溫儲(chǔ)水.

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基[4].基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L):Na2HPO4,0.6 g;KH2PO4,0.2 g;NaNO3,4 g;CaCl2,0.01 g;FeSO4,0.01 g;MgSO4,0.3 g;酵母粉,0.1 g;PH值7.2[5].原油培養(yǎng)基:基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加體積分?jǐn)?shù)為0.1%、2%、60%的原油.液體石蠟培養(yǎng)基:基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加體積分?jǐn)?shù)為2%的液體石蠟.

1.2 方法

1.2.1 菌株分離 將地下儲(chǔ)水在70℃培養(yǎng)箱溫浴15 d后,直接涂LB平板獲取單菌落.挑取不同形態(tài)單菌落接種至LB培養(yǎng)基70℃過夜培養(yǎng).將培養(yǎng)液按5%的接種量分別接種至100 mL體積分?jǐn)?shù)為2%的液體石蠟培養(yǎng)基70℃培養(yǎng)7 d.再將培養(yǎng)液按5%的接種量轉(zhuǎn)接至100 mL 2%(體積分?jǐn)?shù))原油培養(yǎng)基70℃培養(yǎng)15 d,觀察原油乳化情況,并且采用平板計(jì)數(shù)法兩天測(cè)一次菌液中的活菌數(shù).最后選擇原油乳化效果最好、細(xì)菌生長(zhǎng)最旺盛的細(xì)菌進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn).

1.2.2 菌株的鑒定 生理生化特征鑒定見文獻(xiàn)[6-7],菌株的總DNA提取見文獻(xiàn)[8].16S rDNA的擴(kuò)增采用細(xì)菌通用引物:8UA forward:5'-AGA GT T TGA TCMTGG CTC AG-3',reverse:5'-ACG GCT ACC T TG TTA CGA CT T-3',擴(kuò)增條件參照pfu DNA聚合酶(CASarrary)使用說明書.PCR產(chǎn)物的回收采用Gel Extraction Mini Kit(安比奧生物技術(shù)公司)完成.純化產(chǎn)物確認(rèn)后,采用T/A克隆法克隆到pMD18-T Vector(TaKaRa公司)上送華大基因公司測(cè)序.將結(jié)果在 Genebank中進(jìn)行BLAST比對(duì)后,用Clustal X 1.8和MEGA4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[9-10].

最適生長(zhǎng)溫度測(cè)試采用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌,尤尼柯UV2000紫外可見分光光度計(jì)在600 nm處測(cè)量.

1.2.3 菌株在不同烷烴培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)能力測(cè)試

將新鮮單菌落接入LB液體培養(yǎng)基中,65℃過夜培養(yǎng).分別將5 mL培養(yǎng)液用滅菌生理鹽水洗兩遍再接種至含2%(體積分?jǐn)?shù))石油和2%(體積分?jǐn)?shù))液體石蠟的100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基,不添加石油和液體石蠟的為對(duì)照.在65℃、150 r/min培養(yǎng) 18 d,不同時(shí)間間隔取樣測(cè)CFU值.

1.2.4 菌株降黏測(cè)試 以5%的接種量將過夜培養(yǎng)液接入 100 mL原油培養(yǎng)基(原油體積分?jǐn)?shù)為60%),65℃、150 r/min培養(yǎng)18 d.低速離心分離油水混合物,吸取上層原油,在50℃采用 NDJ-8S數(shù)顯黏度計(jì)(上海)測(cè)定黏度.與不接菌的對(duì)照相比較計(jì)算降黏率.

1.2.5 不同鼠李糖脂濃度對(duì)菌株石油降解率的影響 以5%的接種量將過夜培養(yǎng)液分別接入含不同體積分?jǐn)?shù)的鼠李糖脂(0.05%,0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.6%,0.7%)的原油培養(yǎng)基(原油體積分?jǐn)?shù)為0.1%),以不接種的原油培養(yǎng)基為對(duì)照,置于65℃、150 r/min培養(yǎng)18 d,將培養(yǎng)液倒入分液漏斗中,加入20 g NaCl和5 mL H2SO4搖勻,用 30 mL正己烷萃取.取1 mL萃取液注入25 mL容量瓶里,加正己烷定容.在芳烴特征吸收峰波長(zhǎng)256 nm處以正己烷為參比測(cè)定吸光度,根據(jù)事先準(zhǔn)備的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算原油降解率[11].

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

經(jīng)過分離從樣品中獲得6株能夠乳化原油且生長(zhǎng)比較旺盛的菌株,反復(fù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)后選取一株乳化效果最好生長(zhǎng)最旺盛的原油降解菌,命名為YBW1.

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定 將YBW1進(jìn)行形態(tài)觀察及生理生化實(shí)驗(yàn),其結(jié)果如下:菌落顏色,黃褐色;菌落形態(tài),圓形、光滑 ;菌體寬度,0.6～1 μ m;菌體長(zhǎng)度,2～3.5 μ m,革蘭氏染色,+;菌體形狀,桿狀;芽孢,內(nèi)生孢子;運(yùn)動(dòng)性,-;過氧化氫酶,+;氧氣需求,好氧.最適溫度測(cè)試表明其生長(zhǎng)范圍為45～75℃,最適生長(zhǎng)溫度為65℃(圖 1).

圖1 菌株YBW1生長(zhǎng)溫度曲線

2.2.2 菌株的16S rDNA鑒定 對(duì)菌株YBW1的總DNA進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增得到約1.5 kb大小的產(chǎn)物(圖2).將PCR產(chǎn)物回收、測(cè)序,得到1518 bp大小的16S rDNA片段.通過BLAST比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(圖 3)分析表明菌株 YBW1與Geobacillus kaustophilus的序列的相似度為100%,進(jìn)化距離最近.

圖2 菌株YBW116S rDNA PCR產(chǎn)物

圖3 菌株YBW116S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 生長(zhǎng)能力測(cè)試

活菌計(jì)數(shù)獲得YBW1的生長(zhǎng)曲線(圖4)表明菌株YBW1在接種后首先會(huì)利用培養(yǎng)基中的酵母粉進(jìn)行生長(zhǎng),但經(jīng)過3～6 d的適應(yīng)期,YBW1會(huì)先后開始利用液體石蠟和原油中的碳源生長(zhǎng).在第10—13 d,YBW1達(dá)到最大生長(zhǎng)量,此后隨著可利用的碳源逐漸減少,活菌數(shù)量也逐步降低.

圖4 菌株YBW1生長(zhǎng)能力測(cè)試曲線

2.4 原油降黏測(cè)試

通過對(duì)原油的黏度測(cè)試,被菌株YBW1作用后原油黏度從65 mPa·s降低到53 mPa·s,降黏率為18.5%.表明菌株YBW1在生長(zhǎng)過程中可能降解了部分長(zhǎng)鏈烷烴和產(chǎn)生某種起到降黏作用的生物表面活性劑.

2.5 不同鼠李糖脂濃度下菌株石油降解率的測(cè)定

菌株在不同鼠李糖脂濃度下經(jīng)過15 d的作用.原油降解率測(cè)定結(jié)果(圖5)表明:最佳鼠李糖脂添加量為0.2%,此時(shí)獲得最大原油降解率14.3%.當(dāng)鼠李糖脂添加量高于0.3%后會(huì)不同程度降低原油降解率.

圖5 菌株YBW1在不同鼠李糖脂濃度下原油降解率

3 結(jié)論

石油降解菌廣泛存在于被石油污染的土壤、河流和海洋中,并且受環(huán)境影響較大.本文選擇油田地下高溫儲(chǔ)水為樣品成功分離出了一株嗜熱石油降解菌——YBW1.在傳統(tǒng)的生理生化鑒定基礎(chǔ)上采用分子生物學(xué)方法,更加準(zhǔn)確地鑒定出該菌為Geobacillus kaustophilus.

在生長(zhǎng)能力測(cè)試中,菌株YBW1在培養(yǎng)初期的生長(zhǎng)速度沒有在液體石蠟中的快.原因可能是液體石蠟所含有的主要是C12-C18的烷烴,比較容易分散在水中被利用.而原油是由多種不能溶解的成分組成,其中主要是一些長(zhǎng)鏈烷烴(C20以上).所以YBW1會(huì)經(jīng)歷一個(gè)較長(zhǎng)的適應(yīng)期來產(chǎn)生一些生物表面活性劑使原油乳化,從而達(dá)到對(duì)原油利用的目的.當(dāng)原油中的長(zhǎng)鏈烷烴被利用后,原油的黏度也就會(huì)降低.這也是YBW1能降低原油黏度和和鼠李糖脂表面活性劑能提高原油降解率的原因.不過,當(dāng)鼠李糖脂的量過多時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞膜產(chǎn)生破壞作用抑制細(xì)菌生長(zhǎng)[12],從而導(dǎo)致原油降解率下降.

近年來極端環(huán)境微生物的研究逐漸成為微生物學(xué)研究的重點(diǎn),本文在嗜熱石油降解微生物方面做了一些初步探索.下一階段的研究重點(diǎn)將會(huì)放在菌株YBW1利用不同石油烴組分生長(zhǎng)和烷烴降解機(jī)理的研究上.

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