潘衛(wèi)松 肖 瑛

（1.廣州市藥品檢驗所，廣東廣州510610；2.暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510632；3.暨南大學(xué)中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及創(chuàng)新藥物研究廣東省高校重點實驗室，廣東廣州510632）

橄欖油系由油橄欖的成熟核果提煉制成的脂肪油，為常用藥用輔料、溶劑和分散劑。《中國藥典》2010年版二部在正文品種第二部分中收錄該品種，但并未對其細菌內(nèi)毒素進行控制，由此限制了其在注射劑中的應(yīng)用。為此，本研究參照現(xiàn)行中國藥典收載的細菌內(nèi)毒素檢查法[1，2]，對精制橄欖油進行了細菌內(nèi)毒素檢查的方法研究，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

TW12六孔恒溫水浴（Julabo公司）；MSI旋渦混合器（廣州IKA公司）；XS204電子天平（METTLER TOLEDO公司）。

細菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（規(guī)格：每支120EU，批號：150601－200699）由中國藥品生物制品檢定所提供；細菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，規(guī)格：每支50mL，批號：1007161）及鱟試劑（TAL）A（規(guī)格：每支0.1mL，批號：1005071，靈敏度：0.25EU/mL）購自湛江安度斯生物有限公司；TAL B（廈門市鱟試劑實驗廠有限公司，規(guī)格：每支0.1mL，批號：100101，靈敏度：0.25EU/mL；精制橄欖油德國Lipoid GmbH公司，批號：799395，799399，799398。

2 方法與結(jié)果

2.1 細菌內(nèi)毒素限值的確定

根據(jù)企業(yè)資料，本品細菌內(nèi)毒素限值為3EU/g。

2.2 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗

鱟試劑標(biāo)示靈敏度（λ）的復(fù)核按照2010年版《中國藥典》（二部）附錄細菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定進行。結(jié)果見表1。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗結(jié)果

由表1可見，3批鱟試劑λc均在0.5λ～2.0λ之間，符合進行細菌內(nèi)毒素檢查的規(guī)定。

2.3 干擾預(yù)試驗[3-5]

2.3.1 最小有效稀釋濃度 最小有效稀釋濃度c=λ/L，L=0.1 EU/mg，用于藥品檢驗的市售鱟試劑靈敏度一般在 0.25

～0.03EU/mL之間，故精制橄欖油進行細菌內(nèi)毒素檢測時，0.25～0.03EU/mL的鱟試劑相對應(yīng)的最小有效稀釋濃度為83.4mg/mL、41.7mg/mL、20.8mg/mL、10.4mg/mL。

2.3.2 預(yù)試驗 取3批精制橄欖油，用卵磷脂溶液適量及BET水將樣品稀釋成83.4mg/mL、41.7mg/mL、20.8mg/mL、10.4mg/mL共4個濃度梯度的溶液，將此系列濃度溶液標(biāo)記為供試品管（NPC系列）。用上述稀釋液作為溶劑，溶解并稀釋細菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，制得每個稀釋度中細菌內(nèi)毒素含量均為2λ（0.5EU/mL和0.25EU/mL）的精制橄欖油溶液，標(biāo)記此系列溶液為供試品陽性對照管（PPC系列）。取靈敏度為0.25EU/mL的兩個不同廠家的鱟試劑進行試驗，每一稀釋度做2管，同時按常規(guī)分別設(shè)細菌內(nèi)毒素陽性對照（PC）和檢查用水陰性對照（NC）各2管，結(jié)果見表2。

表2 樣品干擾預(yù)試驗結(jié)果

從表2可見，所用的3批精制橄欖油稀釋到83.4mg/mL或以下濃度的溶液時，對兩個廠家的鱟試劑與細菌內(nèi)毒素反應(yīng)均無增強或抑制的干擾作用。

2.4 正式干擾試驗

用兩個廠家的鱟試劑（靈敏度為0.25EU/mL），按現(xiàn)行中國藥典方法進行試驗，測定用BET水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（Es）和用供試品稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（Et）。取3批精制橄欖油，分別加卵磷脂溶液適量及 BET水稀釋成 83.4mg/mL（批號：799395，799399，799398），用BET水和供試品稀釋液將細菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成2λ、1λ、0.5λ、0.25λ濃度的BET水系列細菌內(nèi)毒素溶液和供試品稀釋液系列細菌內(nèi)毒素溶液，每一稀釋濃度重復(fù)4管，同時用上述供試品稀釋液和BET水各做2管陰性對照管，按下列公式計算BET水和供試品稀釋液反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（Es和Et），Es=lg-1（∑Xs/4），Et=lg-1（∑Xt/4），結(jié)果見表3。

從表3結(jié)果可見，2λ管均為陽性，0.5λ、0.25λ管均為陰性，對于λ=0.25EU/mL的2組鱟試劑的Es為0.25EU/mL，Es均在0.5λ～2.0λ范圍內(nèi)，3批精制橄欖油測得的Et均在0.5λ～2.0λ范圍內(nèi)，Et和Es的比值在0.5～2.0之間，說明精制橄欖油在83.4mg/mL或以下濃度的溶液對兩個不同廠家的鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)無增強或抑制的干擾作用，符合現(xiàn)行中國藥典對細菌內(nèi)毒素檢查有效性的規(guī)定，因此可以確定精制橄欖油的最大無干擾濃度為83.4mg/mL。

表3 樣品（83.4m g/m L）干擾試驗結(jié)果

2.5 樣品細菌內(nèi)毒素檢查

取3批精制橄欖油，分別根據(jù)“2.4”項下方法制成供試品稀釋液，使用λ=0.25EU/mL的兩個廠家的鱟試劑進行細菌內(nèi)毒素檢查，并用此稀釋液將細菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為2λ的溶液，作為供試品的陽性對照，另外以細菌內(nèi)毒素檢查用水建立陽性對照和陰性對照。按現(xiàn)行中國藥典部細菌內(nèi)毒素檢查法檢查，結(jié)果見表4。陰性對照管（NC）均為陰性，供試品陽性對照管（PPC）和陽性對照管（PC）均為陽性，實驗成立；供試品管（NPC）均為陰性，表明樣品中未檢出細菌內(nèi)毒素，3批精制橄欖油的細菌內(nèi)毒素檢查均符合規(guī)定。

表4 樣品細菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

3 討論

熱原檢查是腸外給藥制劑及原料重要的質(zhì)量控制項目。細菌內(nèi)毒素檢查法目前已被各國藥典廣泛采納，作為替代熱原檢查法的體外檢測方法之一應(yīng)用于藥品的質(zhì)量控制，但該方法存在易受到各種檢測因素干擾的缺點，故在中藥制劑，生物制品和藥用輔料的檢測上還存在著不少限制。本研究探討了細菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用于藥用輔料的可行性，為提高藥用輔料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進行了初步的探索[6-8]。

不同廠家的鱟試劑由于生產(chǎn)工藝，質(zhì)量參數(shù)等方面有一定差異，其抗干擾能力也存在差異。因此，本研究采用兩個不同廠家不同靈敏度的鱟試劑對3個批號的樣品進行試驗。從正式干擾試驗結(jié)果可見，樣品稀釋至83.4mg/mL濃度時，Es或Et均在0.5～2.0范圍之內(nèi)，可認(rèn)為精制橄欖油在該濃度下不干擾細胞內(nèi)毒素檢查。

用兩個廠家鱟試劑與3批樣品進行細菌內(nèi)毒素檢查，樣品中細菌內(nèi)毒素限量均在3EU/g限值以下。因此，藥用輔料精制橄欖油采用限值3EU/g進行細菌內(nèi)毒素檢查法控制熱原質(zhì)是可行的。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄99.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：1252.

[3]汪穗福，蘇廣海，勞海燕，等.對中國藥典（2005年版一部）細菌內(nèi)毒素檢查法的建議[J].中醫(yī)藥信息，2004，21（1）：57-58.

[4]潘衛(wèi)松，肖瑛.透明質(zhì)酸鈉注射液細菌內(nèi)毒素檢查法的研究[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2009，6（6）：45-47.

[5]潘衛(wèi)松，肖瑛，潘建明.熒光素鈉注射液細菌內(nèi)毒素檢查法的研究[J].中國藥房，2009，20（13）：1010-1012.

[6]周永標(biāo)，潘衛(wèi)松.從葛根素的異常毒性實驗看藥用輔料的重要性[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2010，7（13）：47-48.

[7]潘衛(wèi)松，肖瑛，李薇.皮膚組織中SOD活性測定的樣品制備方法[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2010，7（32）：27-28.

[8]潘衛(wèi)松，劉美鳳，石鉞，等.血清藥理學(xué)、血清化學(xué)和中藥藥代動力學(xué)[J].世界科學(xué)技術(shù)一中藥現(xiàn)代化，2002，4（3）：53-56.