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        金屬納米顆粒對(duì)蛋白核小球藻生長活性的影響

        2011-03-20 03:42:26汪靜劉婭琛曲冰潘超趙巳茹
        關(guān)鍵詞:小球藻生物量毒性

        汪靜,劉婭琛,曲冰,潘超,趙巳茹

        (1.大連海洋大學(xué)理學(xué)院,遼寧大連116023;2.威海職業(yè)學(xué)院生物與化學(xué)工程系,山東威海264210)

        金屬納米顆粒對(duì)蛋白核小球藻生長活性的影響

        汪靜1,劉婭琛2,曲冰1,潘超1,趙巳茹1

        (1.大連海洋大學(xué)理學(xué)院,遼寧大連116023;2.威海職業(yè)學(xué)院生物與化學(xué)工程系,山東威海264210)

        研究了金屬Fe、Ni納米顆粒對(duì)蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa生長活性的影響,探討了金屬納米材料的生物安全性問題。結(jié)果表明:Fe、Ni金屬納米顆粒不僅能吸附在藻細(xì)胞表面,造成其團(tuán)聚沉淀,而且還能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,引起細(xì)胞的形變和結(jié)構(gòu)損傷,從而抑制了小球藻的正常生長,降低小球藻的生物量,對(duì)小球藻具有一定的毒性效應(yīng)。

        小球藻;金屬納米顆粒;毒性效應(yīng)

        由于納米顆粒尺寸很小,結(jié)構(gòu)特殊,因此具有許多優(yōu)良且奇異的物理化學(xué)特性,如小尺寸效應(yīng)、巨大的表面效應(yīng)、界面效應(yīng)、極高的反應(yīng)活性、量子效應(yīng)等,這些特性使其在醫(yī)藥、工業(yè)、建筑、化妝品和環(huán)保等產(chǎn)業(yè)中有著越來越廣泛的應(yīng)用前景[1-2]。其中金屬納米顆粒,如Fe等金屬磁性納米顆??梢詮V泛地應(yīng)用于磁性油墨、磁記錄、靜電復(fù)印、磁性流體、醫(yī)學(xué)及磁共振顯影劑等[1-3]。因此,人們的生存環(huán)境不可避免地受到金屬納米顆粒的影響。同時(shí),金屬納米顆粒也進(jìn)入到海洋生態(tài)環(huán)境中,進(jìn)而通過食物鏈威脅人類的健康。目前國內(nèi)外對(duì)納米顆粒影響海洋生物安全性的研究不多,主要集中在動(dòng)物組織生理生化檢測[3-4]、微生物群體研究[5]等方面,另外還涉及較多重金屬對(duì)藻類細(xì)胞影響的研究等[6-7]。

        小球藻的細(xì)胞小,繁殖快,而且易獲得,對(duì)毒物也較敏感。因此,小球藻是一種很好的測試生物,在較短時(shí)間內(nèi)即可獲得毒物對(duì)其多個(gè)世代及種群水平的影響評(píng)價(jià)。此外,研究納米顆粒對(duì)其生長活性的影響作用機(jī)制同樣適用于多細(xì)胞生物。本研究中,作者以蛋白核小球藻為測試生物,研究了兩種金屬納米顆粒(Fe和Ni)對(duì)藻類生物的安全性,旨在為促進(jìn)納米科技的健康發(fā)展、納米技術(shù)產(chǎn)品的安全應(yīng)用提供參考資料。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        試驗(yàn)用蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa由大連海洋大學(xué)遼寧省水生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供,培養(yǎng)液采用康威營養(yǎng)液配制。海水取自大連黑石礁海域,經(jīng)沙濾后使用。金屬納米顆粒Fe和Ni由太極環(huán)納米制品有限公司生產(chǎn),粒徑為(20±1)nm。

        試驗(yàn)用主要儀器有:生物顯微鏡(XSP-8CE型40X-1600X),微量臺(tái)式小型離心機(jī)(D-37520型),透射電子顯微鏡TEM(JEM-1200EX型),超聲清洗儀(KH-500DB型),紫外-可見分光光度計(jì)(UV-1800型),智能光照培養(yǎng)箱(HP 300G型)。

        1.2 方法

        1.2.1 小球藻的培養(yǎng) 試驗(yàn)在250 mL錐形瓶中進(jìn)行。將海水煮沸冷卻后加入康威營養(yǎng)液(每升海水中加入1 mL康威營養(yǎng)液),再將處于對(duì)數(shù)生長期的小球藻接種到錐形瓶中,置于智能光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),溫度為(25±1)℃,光照為3 000 lx,光暗比為12∶12,試驗(yàn)藻液總量為100 mL。毒性試驗(yàn)的周期為5~6 d,其中急性毒性試驗(yàn)周期為96 h。將納米顆粒的試驗(yàn)濃度設(shè)為0、0.4、2、10、25、50、100、200 mg/L,每個(gè)濃度組設(shè)3個(gè)水平。

        每日定時(shí)搖晃,盡量使納米顆粒與小球藻充分作用,每24 h在波長為680 nm處測定其吸光值,96 h時(shí)鏡檢,同時(shí)留取TEM觀察的樣品。

        1.2.2 小球藻生物量的測定 為實(shí)現(xiàn)小球藻生物量計(jì)數(shù)的快速準(zhǔn)確,本研究中采用顯微直接計(jì)數(shù)法和光密度(OD)測量法分別測量小球藻濃度值和吸光度值,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后根據(jù)相對(duì)誤差分析和數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析得出該曲線相關(guān)性較強(qiáng),董正臻等[8]也證明了兩者具有較高的相關(guān)性。使用吸光度值作為藻類生物量指標(biāo)的方法更準(zhǔn)確、方便,因此本研究中采用該方法確定小球藻的生物量。

        1.2.3 TEM分析 TEM分析是觀察納米顆粒的進(jìn)出機(jī)制,以及對(duì)細(xì)胞內(nèi)部組織造成的影響的手段之一。首先制作超薄切片,再用雙染色法染色之后置于TEM下觀察分析。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 對(duì)小球藻生物量的抑制效應(yīng)

        由圖1可看出,隨著Ni納米顆粒濃度的增加,其對(duì)小球藻生物量的抑制效應(yīng)增大。Ni納米顆粒的濃度為0.4~25 mg/L時(shí),其抑制效應(yīng)較小;濃度超過50 mg/L時(shí),初期(≥24 h)就出現(xiàn)抑制效應(yīng),并隨著時(shí)間的推移毒性作用越來越明顯。李永仙等[9]用氧化鎳納米顆粒對(duì)小球藻的試驗(yàn)結(jié)果也得出相似的規(guī)律。

        圖1 不同濃度的Ni、Fe納米顆粒對(duì)小球藻生物量的影響Fig.1 Effects of Ni,and Fe nanoparticles on biomass of Chlorella pyrenoidosa under different concentrations

        由圖1可看出:Fe納米顆粒的濃度為0.4 mg/L時(shí),其對(duì)小球藻的活性影響很小;隨著濃度的增加,抑制作用也越來越明顯,Fe納米顆粒濃度為25~200 mg/L時(shí),初期就出現(xiàn)抑制效應(yīng),并隨著時(shí)間的推移毒性作用越來越明顯。從Fe和Ni比較來看,較小劑量的Fe納米顆粒就可對(duì)小球藻產(chǎn)生毒性效應(yīng),而Ni納米顆粒則需要在較大的劑量下(≥50 mg/L)才會(huì)產(chǎn)生比較明顯的毒性效應(yīng)。

        金屬納米顆粒對(duì)小球藻產(chǎn)生毒性作用可能與其在水溶液中分解出可溶性金屬離子有關(guān)[10]。傅鳳等[11]研究了納米銅粉對(duì)藻類細(xì)胞的影響,結(jié)果表明,金屬納米顆粒對(duì)藻類具有一定的毒性,且產(chǎn)生一定的抑制效應(yīng);朱小山等[12]的試驗(yàn)結(jié)果也表明,氧化鋅對(duì)藻類細(xì)胞有抑制作用。由此可見,金屬納米顆粒對(duì)小球藻存在顯著的抑制效應(yīng)。

        2.2 對(duì)小球藻團(tuán)聚沉淀的影響

        將錐形瓶中的培養(yǎng)液搖勻,在同一液層取樣,然后在生物顯微鏡下鏡檢并拍照(圖2、圖3)。在沒有加入納米顆粒時(shí),小球藻分布均勻,無團(tuán)聚現(xiàn)象(圖2-(a)、圖3-(a));加入較高濃度的納米顆粒后,導(dǎo)致液體中出現(xiàn)不規(guī)則的團(tuán)聚體(圖2-(b)和圖3-(b));將圖2-(b)和圖3-(b)中的局部放大,可見團(tuán)聚體主要是由小球藻組成,局部包裹著納米顆粒(圖2-(c)和圖3-(c))。由于納米顆粒具有較強(qiáng)的吸附性,而藻類細(xì)胞也具有較強(qiáng)的吸附毒物的能力[13-15],導(dǎo)致納米顆粒吸附在小球藻表面。從圖3可見,Fe的納米顆??梢允剐∏蛟逍纬奢^大、較多的團(tuán)聚體,因而對(duì)小球藻的生長活性產(chǎn)生抑制效應(yīng)。金屬納米顆粒的高表面能的性質(zhì)使其極易在海水中團(tuán)聚沉淀,所以較高濃度的納

        米顆??赡軐?dǎo)致小球藻形成團(tuán)聚體后產(chǎn)生沉淀,這可能是金屬納米顆粒對(duì)小球藻毒性作用的方式之一。

        圖2 金屬納米顆粒Ni對(duì)小球藻團(tuán)聚的影響(96 h)Fig.2 The aggregation of Ni nanoparticles to Chlorella pyrenoidosa at 96 h

        圖3 金屬納米顆粒Fe對(duì)小球藻團(tuán)聚的影響(96 h)Fig.3 The aggregation of Fe nanoparticles to Chlorella pyrenoidosa at the 96 h

        2.3 不同條件下小球藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分析

        未添加納米顆粒時(shí),小球藻結(jié)構(gòu)清晰完整,細(xì)胞呈球形,葉綠體中的類囊體片層結(jié)構(gòu)清晰且面積較大,可看到結(jié)構(gòu)完整清晰的細(xì)胞核、細(xì)胞壁、高爾基體和線粒體等(圖4-(a)、(b))。加入Ni納米顆粒96 h后,小球藻細(xì)胞形變程度較大,且結(jié)構(gòu)損傷十分明顯,此時(shí)藻細(xì)胞發(fā)生了明顯的質(zhì)壁分離現(xiàn)象,且質(zhì)壁分離程度較大,有的藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)無法辨明(圖4-(c)、(d)、(e))??梢钥吹筋惸殷w的層狀結(jié)構(gòu)模糊且面積縮小,細(xì)胞核的膜界限不清,線粒體形狀發(fā)生改變,且線粒體膜的界限十分模糊,嵴狀結(jié)構(gòu)也不明顯,液泡面積較大且其中有較大的納米顆粒(圖4-(d))。將圖4-(d)局部放大,在液泡中可以十分清楚地看到團(tuán)聚的納米顆粒(圖4-(e))。加入Fe納米顆粒96 h時(shí),小球藻細(xì)胞出現(xiàn)形變,結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損傷,此時(shí)藻細(xì)胞出現(xiàn)質(zhì)壁分離的現(xiàn)象,部分細(xì)胞即將溶解,類囊體面積縮小,其層狀結(jié)構(gòu)幾乎消失,內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂,線粒體形狀發(fā)生改變,嵴數(shù)量減少,液泡數(shù)量較多,液泡中有較大團(tuán)聚的納米顆粒(圖4-(f)、(g))。這與Clifford等[16]、Kyung等[17]對(duì)硅納米材料的研究結(jié)果十分相似。

        在兩種金屬納米顆粒作用下,小球藻細(xì)胞內(nèi)的液泡中都包裹著納米顆粒,但在Fe納米顆粒作用下的小球藻液泡數(shù)量卻增加不少。這種現(xiàn)象是否為小球藻自身的一種解毒方式[18],還有待于進(jìn)一步

        研究。Nan等[19]也在透射電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)了硅納米管進(jìn)入細(xì)胞中,并被空泡結(jié)構(gòu)包裹的現(xiàn)象,表明金屬納米顆??梢赃M(jìn)入藻細(xì)胞內(nèi)部并對(duì)其內(nèi)部結(jié)構(gòu)造成一定損傷。

        圖4 不同條件下96 h時(shí)透射電子顯微鏡下小球藻的細(xì)胞結(jié)構(gòu)Fig.4 TEM images of Chlorella pyrenoidosa for the 96 h under different conditions

        3 結(jié)束語

        本試驗(yàn)中,研究了兩種金屬納米顆粒對(duì)測試生物小球藻的活性影響,結(jié)果表明:

        1)金屬Fe、Ni納米顆粒對(duì)小球藻具有一定的毒性效應(yīng),且存在劑量-效應(yīng)關(guān)系,并隨著作用時(shí)間的增加,抑制效應(yīng)越發(fā)明顯。

        2)金屬Fe、Ni納米顆粒極有可能附著在細(xì)胞的表面,使藻細(xì)胞團(tuán)聚沉淀,還可以改變細(xì)胞膜的通透性,并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,損傷葉綠素類囊體的片層結(jié)構(gòu),從而影響藻類的光合作用。

        3)將兩種金屬納米顆粒的所有試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比之后得出,Fe納米顆粒在較小劑量下就可對(duì)小球藻產(chǎn)生毒性效應(yīng),而Ni納米顆粒則需要在較大的劑量下(≥50 mg/L)才會(huì)產(chǎn)生比較明顯的毒性效應(yīng)。

        隨著金屬納米顆粒的廣泛應(yīng)用,納米顆粒對(duì)水生生物的安全性問題日漸凸顯,因此,與金屬納米顆粒相關(guān)的毒性機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究,以便為環(huán)境安全評(píng)價(jià)系統(tǒng)的建立提供更多依據(jù),在保證納米技術(shù)可持續(xù)發(fā)展的同時(shí)也使生態(tài)環(huán)境能夠健康發(fā)展。

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        The effect of the metal nanoparticles(Fe/Ni)on growth in algaChlorella pyrenoidosa

        WANG Jing1,LIU Ya-chen2,QU Bing1,PAN Chao1,ZHAO Si-ru1
        (1.School of Science,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;2.Department of Biological and Chemical Engineering, Weihai Vocational College,Weihai 264210,China)

        The effect of the metal nanoparticles(Fe and Ni)on growth in alga Chlorella pyrenoidosa was studied to evaluate bio-security of the nanomaterials.The results showed that the biomass of the alga was reduced by the both metal nanoparticles which entered into the cells,and caused the cells deformation and damage in structure.The metals were absorbed by the cell surface and led to the alga aggregation.Thus,it is concluded that the metals are toxic to Chlorella pyrenoidosa.

        Chlorella pyrenoidosa;metal nanoparticles;toxic effect

        X55

        A

        2095-1388(2011)05-0386-05

        2011-01-20

        國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(50773010);遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(2008228002);遼寧省教育廳科技研究項(xiàng)目(2009A172)

        汪靜(1966-),女,教授,博士。E-mail:wangj@dlou.edu.cn

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