郭 鐵

南陽醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院 南陽 473000

慢性腦缺血是指因動脈粥樣硬化等因素造成的長期腦部慢性缺血,進而導(dǎo)致腦代謝障礙和功能衰退,其癥狀主要包括,眩暈、耳鳴、智力減退、記憶力下降或注意力不集中、定向力障礙等,患病率較高。突觸素(synaptophysin)是一種位于突觸囊泡膜上與突觸功能密切相關(guān)的多糖膜結(jié)構(gòu)蛋白,具有縫隙連接樣通道性質(zhì)并參與Ca2+依賴神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿、谷氨酸的釋放[1]。谷氨酸受體NMDAR有兩個顯著區(qū)別其他谷氨酸受體的特性,第一是具有電壓依賴的Mg2+離子阻斷作用,第二是NMDA受體不僅對單價離子Na+、K+有通透性,且對Ca2+也具有高通透性。NMDA受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中有重要作用,可調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活、樹突和軸突的結(jié)構(gòu)發(fā)育、突觸的可塑性及突觸重排等,在神經(jīng)回路的形成及學(xué)習記憶過程中,NM DA受體也有促進作用。NR2B是NMDAR中的主要功能亞單位[2]。本實驗旨在觀察慢性腦缺血老齡大鼠海馬區(qū)突觸素及NR2B表達的變化,以探尋治療慢性腦供血不足的方法。

1 材料和方法

1.1 藥品及試劑 小鼠抗突觸素單克隆抗體,兔抗NR2B親和純化兔抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司;SP免疫組化試劑盒,DAB顯色劑均購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.2 動物分組 健康Wistar大鼠100只,隨機分為5組,A組(假手術(shù)組)、B組(缺血4周組)、C組(缺血8周組)、D組(缺血12周組)、E組(缺血16周組),每組20只。

1.3 動物模型的制作 參照Ohta[3]等制作慢性腦缺血動物模型的方法,結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈,對照組除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈外,其他處理同動物模型制作。

1.4 免疫組化結(jié)果的分析 采用上海山富科學(xué)儀器有限公司提供的Biosens Digital Imaging System病理圖文分析系統(tǒng)進行結(jié)果分析。每張切片在目標區(qū)域隨機選取5個視野測定其灰度值,采集5組數(shù)據(jù),取其平均值作為該切片目標區(qū)域的平均灰度值。每組切片依次完成檢測,計算該組切片被檢區(qū)域灰度值的平均值及標準差。

2 結(jié)果

2.1 突觸素 CA1區(qū)以多形層和輻射層染色較深,腔隙分子層次之,錐體層和顆粒層細胞的輪廓有點狀標記。CA3區(qū)苔蘚纖維層可見較多顆粒,齒狀回染色較淺。各組間突觸素表達水平的比較顯示,缺血第4、8、12周及16周組突觸素灰度值分別低于對照組(P＜0.05);缺血第12周及第16周組還分別低于缺血第4、8周組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);其余各組間相比,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠海馬不同區(qū)域突觸素灰度值比較 (±s)

表1 各組大鼠海馬不同區(qū)域突觸素灰度值比較 (±s)

?

2.2 NR2B CA1區(qū)錐體細胞胞膜著色較強,放射層及腔隙分子層的頂樹突染色強度和錐體細胞胞膜呈基本相同的較強染色。在CA3區(qū),胞膜染色較強,胞質(zhì)染色較淡,透明層及放射層的頂樹突基本不著色,僅基部存在著色。齒狀回顆粒細胞密集排列,呈現(xiàn)小空泡狀。各組間NR2B表達水平的比較顯示,缺血第4、8、12以及16周組NR2B灰度值分別低于對照組(P＜0.05);缺血第12周及第16周組還分別高于缺血第4、8周組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);其余各組間相比,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 各組大鼠海馬不同區(qū)域NR2B灰度值的比較 (±s)

表2 各組大鼠海馬不同區(qū)域NR2B灰度值的比較 (±s)

?

3 討論

突觸是神經(jīng)系統(tǒng)中最基本的功能單位,其對大腦整體功能的維持有至關(guān)重要的作用。突觸的發(fā)育和其功能的發(fā)揮都與突觸素密切相關(guān)。突觸素(synaptophysin)主要分布于含經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)的小型突觸小泡膜上[4]。突觸小泡中含有高濃度的化學(xué)遞質(zhì),當Ca2+與突觸素結(jié)合后,能誘導(dǎo)小泡膜去極化,啟動小泡膜與突觸前膜連接形成孔道樣結(jié)構(gòu),使神經(jīng)遞質(zhì)由小泡釋放至突觸間隙,產(chǎn)生傳遞效應(yīng)[5]。另外,突觸素還與突觸的形成密切相關(guān)[6]。突觸的數(shù)量及其結(jié)構(gòu)的完整性關(guān)系到大腦記憶學(xué)習等功能的正常發(fā)揮[7-8]。在本試驗中慢性腦缺血模型大鼠海馬突觸素的表達在第4、8、12、16周逐漸減少,意味著其記憶學(xué)習等功能的減退,而出現(xiàn)慢性腦缺血的癥狀。

大腦學(xué)習和記憶功能并非單純突觸素的作用,另有研究發(fā)現(xiàn)敲除小鼠NR2B基因后,其記憶能力下降;而移植轉(zhuǎn)染NR2B基因細胞可使大鼠記憶明顯增高;學(xué)習過程也可以提高NR2B通道蛋白的磷酸化程度[2]。Clayton[9]的研究發(fā)現(xiàn),老年大鼠較青年大鼠腦內(nèi)NR2BmRNA和蛋白質(zhì)均明顯減少,而N R1、NR2A、AM PAR、GluR2的表達未見減少,提示老年大鼠的NR2B表達減少,長時程增強受損,學(xué)習記憶出現(xiàn)障礙。其表達減少,與學(xué)習記憶功能的減退呈相關(guān)性。在本試驗中發(fā)現(xiàn),慢性腦缺血模型大鼠海馬NMDA受體亞單位NR2B的表達在第4、8、12、16周逐漸減少。

慢性腦缺血老齡大鼠海馬中突觸素及NR2B的表達,隨時間延長逐漸減少,這些表達的變化,在慢性腦缺血癥狀的發(fā)展中,起到了重要的作用,進一步針對其作用機制進行研究,有利于對慢性腦缺血進行有效的治療。

[1] Lauri SE,Lamsa K,Pavlov I.Activity blockade increases the number of functional synapses in the hippocampus of newborn rats[J].Mol Cell Neurosci,2003,22(1):107-171.

[2] Bliss TV.Yong receptors make smart mice[J].Nature,1999, 401:25.

[3] Ohat H,Nishikawa H,Mmura H,et al.Chronic cerebral hypoperfusion by permanentinternal carotid ligation produces learning impairment without brain damage in rats[J].Neurosciences,1997,79(4):1 039-1 050.

[4] Levy HI,Hanscom B,Boden SD.Three-question depression screener used for lumbar disc herniation and spinal stenosis [J].Spine,2002,27(11):1 232-1 237.

[5] Sze CI,Bi H.Selective regional loss of ex ocytotic presynaptic vesicle proteins in Alzheimer's disease brains[J].J Neurol Sci, 2000,175(2):81-90.

[6] 張燕平,劉其強,白宏英.雌激素對慢性腦缺血大鼠認知功能及突觸素的影響[J].中國實用神經(jīng)疾病雜志,2007,10(1); 107-171.

[7] Janz R,Sudhof TC,Hammer RE,et al.Essential roles in synaptic plasticity for synaptogyrinⅠand synaptophysin[J].Neuron,1999,24(3):671-687.

[8] Bolay H,Gursoy-Ozdemir Y,Sara Y.Persistent defect in transmitter release and sy napsin phosphory lation in cerebral cortex after transient moderate ischemic injury[J].Stroke, 2002,33(5):1 369-1 375.

[9] Clayton DA,Browing MD.Deficits in expression of the N R2B subunit in the hippocampus of aged Fisher 344 rats[J].Neurobiology of Aging,2001,22(1):165.