毛跟年,李 鑫,瞿建波

陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,西安 710021

乙醛脫氫酶及其醫(yī)療領(lǐng)域研究進(jìn)展

毛跟年＊,李 鑫,瞿建波

陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,西安 710021

對(duì)乙醛脫氫酶的種類、基本特性、制備、檢測及其在醫(yī)療領(lǐng)域中應(yīng)用作了簡要的概述,旨在為該酶的進(jìn)一步研究提供參考。

乙醛脫氫酶;性質(zhì);臨床應(yīng)用

Abstract:This article reviews the types,basic characteristics,preparation,testing,and application in the medical field of aldehyde dehydrogenase.In order to provide some references for its advanced research.

Key words:aldehyde dehydrogenase;characteristics;clinical

乙醛脫氫酶 (aldehyde dehydrogenase,ALDH)廣泛存在于真核生物和原核生物中,在輔酶 I存在的條件下,它催化包括乙醇在內(nèi)的某些一級(jí)或二級(jí)醇、醛和酮的脫氫反應(yīng)[1]。在人類和其他許多動(dòng)物體內(nèi),線粒體乙醛脫氫酶能把對(duì)生物體有害的醇類轉(zhuǎn)化,所以在細(xì)胞解毒研究中乙醛脫氫酶受到高度關(guān)注[2];同時(shí),乙醛脫氫酶在分子生物學(xué)以及相關(guān)疾病的檢測方面也多有應(yīng)用。因此,乙醛脫氫酶的研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。文中從乙醛脫氫酶的種類、性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、制備、酶活測定及其在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用幾個(gè)方面綜述了乙醛脫氫酶的研究進(jìn)展。

1 乙醛脫氫酶的種類

乙醛脫氫酶家族 (ALDHs)是一系列氧化各式各樣脂肪族醛、芳香族醛為相應(yīng)酸的酶[3]。哺乳動(dòng)物乙醛脫氫酶根據(jù)其亞細(xì)胞所在位置、結(jié)構(gòu)與動(dòng)力學(xué)特性和原始序列的相似性可以分為三類[4]。第一類是細(xì)胞質(zhì)的 (ALDH1),第二類是線粒體的 (ALDH2),第三類則是可誘導(dǎo)性的細(xì)胞質(zhì)的乙醛脫氫酶和可誘導(dǎo)性的微粒體的乙醛脫氫酶 (如 ALDH3)。目前,對(duì)前兩類乙醛脫氫酶進(jìn)行了廣泛的研究,并發(fā)現(xiàn)其有效促使短鏈脂肪族醛和芳香族醛的氧化。相比較之下對(duì)第三類乙醛脫氫酶的研究較少特別是對(duì)微粒體乙醛脫氫酶的研究,大鼠肝臟、兔子腸道、人類肝臟和人白血細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)了微粒體乙醛脫氫酶的存在[1],但作用機(jī)制尚不明確。

2 人類乙醛脫氫酶性質(zhì)和結(jié)構(gòu)

人體乙醛脫氫酶為多肽四聚體,根據(jù)四元結(jié)構(gòu)和其他生化特征,至少有 7種不同基因編碼 ALDH(ALDH1、ALDH2……ALDH7),但根據(jù)底物特異性和亞單位組成,只有 ALDH1和 ALDH2才被認(rèn)為是“真”ALDHs,為人體肝內(nèi)的兩種主要同工酶,他們的基因分別位于 9號(hào)和 12號(hào)染色體。ALDH2位于線粒體內(nèi),而 ALDH1、ALDH3、ALDH4位于胞液內(nèi)。ALDH1和 ALDH2為純四聚體,由分子量為 54000的亞單位組成,含 500-501個(gè)氨基酸,他們的氨基序列中 68%是相同的[5],并且具有相類似的三維立體結(jié)構(gòu)[6-8]。人類紅細(xì)胞含有一種 ALDH,和肝細(xì)胞液內(nèi)的 ALDH1相同。ALDH2表現(xiàn)出遺傳多態(tài)性,ALDH2缺乏者有一個(gè)或兩個(gè)等位基因突變,形成純合子或雜合子,為常染色體顯性遺傳。突變的非典型ALDH2基因形成功能喪失的酶即非典型雜四聚體酶 (aaab、aabb、abbb、b表示非典型亞單位 )和非典型純四聚體 (bbbb),不能有效代謝乙醛。

3 乙醛脫氫酶的制備

目前,天然的 ALDH難以獲得,大多是從動(dòng)物的肝臟、胰腺或肝細(xì)胞線粒體中提取,其資源有限且價(jià)格昂貴,因此很難大規(guī)模生產(chǎn),為了拓展 ALDH的來源,科學(xué)家們探索從微生物中提取 ALDH。國外在此方面做了大量工作,早在上個(gè)世紀(jì) 70年代,Keith A.Bostian[9]就對(duì)從釀酒酵母中提取 ALDH進(jìn)行了研究。國內(nèi)吳桂英等[10]報(bào)道了從破碎酵母細(xì)胞提取 ALDH的新工藝,考察了自溶、反復(fù)凍融、超聲波和高壓破碎儀的細(xì)胞破碎方法對(duì)釋放 ALDH的影響;周百靈等[11]利用超聲波破碎、硫酸銨分級(jí)鹽析以及 DEAE-32陰離子交換層析等方法提取了釀酒酵母胞漿內(nèi)的 ALDH并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究,這就為酶的獲得提供了寶貴資料。

在探討從微生物中提取乙醛脫氫酶的同時(shí),學(xué)者們還通過對(duì)菌種定向誘變和培養(yǎng)基優(yōu)化提高微生物的酶產(chǎn)量。劉清利[12]等通過紫外線和 He-Ne激光誘變醋酸菌,選育出 1株乙醛脫氫酶高產(chǎn)菌株Z07-J01,該正突變 24 h發(fā)酵酶活為 1008.00 U/g濕菌體,比出發(fā)株提高了 276%,且酶活在 10代內(nèi)穩(wěn)定;王紅波[13]等通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn),對(duì)巴氏醋桿菌產(chǎn)乙醛脫氫酶的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化,確定了培養(yǎng)基的最適條件和組分,提高了發(fā)酵培養(yǎng)生物量和產(chǎn)酶酶活;吳桂英[14]等人還對(duì)對(duì)酶學(xué)性質(zhì)及發(fā)酵條件也進(jìn)行了初步的研究,得到釀酒酵母產(chǎn)乙醛脫氫酶的最優(yōu)發(fā)酵條件。

4 乙醛脫氫酶的測定

乙醛脫氫酶的測定可以采用多種不同的體系,常用的ALDH酶活測定采用脫氫酶酶活測定的方法。酶、輔酶 NAD+和底物在一定溫度和 pH的條件下反應(yīng),通過每分鐘波長 340 nm處吸光度值的變化,可以算出每分鐘 NAD+轉(zhuǎn)化為 NADH的量,從而得到該酶酶活[15]。一般定義每分鐘波長 340 nm處吸光度值變化 0.001為一個(gè)活力單位 (U)。常用的檢測體系有 O K IB E[16]的 3 mL反應(yīng)體系;Keirh A.Bostian的 2.5ml檢測體系等。

5 乙醛脫氫酶在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用研究

5.1 乙醛脫氫酶與酒精中毒

各種酒類都含有乙醇,可引起飲酒后臉紅、心跳加速、皮膚加熱、血壓升高的急性酒精中毒癥狀,但這主要不是由于血液中乙醇濃度的升高,而是由于血液中乙醛濃度的升高造成的;研究表明[17],乙醛具有強(qiáng)烈的毒理作用,可刺激腎上腺素、去甲腎上腺素等物質(zhì)的分泌,引起面紅耳赤、心率快、皮溫高等癥狀。而人類對(duì)酒精耐受性有種族的和個(gè)體的差異,黃種人中 80%為酒精敏感者,白種人中僅 5%為酒精敏感者。大多數(shù)黃種人在飲酒后產(chǎn)生乙醛速度快,而氧化為乙酸的速度慢,故易產(chǎn)生乙醛蓄積中毒[18]。也就是說,乙醛脫氫酶的不足使乙醛在體內(nèi)積累導(dǎo)致中毒現(xiàn)象,乙醛對(duì)引起急性酒精中毒癥狀比乙醇起更重要的作用。解酒重在加速乙醛的分解,使之產(chǎn)生乙酸,進(jìn)一步分解為 CO2和 H2O,而在此過程中乙醛脫氫酶的作用尤為重要。

5.2 乙醛脫氫酶與肝損傷

乙醛可以作為高活性物質(zhì),與乙醇性肝損傷的發(fā)展密切相關(guān)。肝細(xì)胞線粒體內(nèi)的乙醛可被 ALDH氧化為乙酸,當(dāng) ALDH活性降低時(shí),未被氧化的乙醛進(jìn)入血內(nèi),通過黃嘌呤氧化酶轉(zhuǎn)變?yōu)槌趸?進(jìn)而導(dǎo)致膜脂質(zhì)過氧化,丙二醛和壬烯是 2個(gè)強(qiáng)毒力的脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物,常作為判斷脂質(zhì)過氧化的指標(biāo)。他們可進(jìn)一步促進(jìn)枯否細(xì)胞和肝細(xì)胞釋放細(xì)胞因子,破壞細(xì)胞膜,最終促進(jìn)肝損傷[19]。同時(shí),Surrenti[20]等還觀察到 ALDH活性的減弱與肝損傷的程度是平行發(fā)展的。

5.3 乙醛脫氫酶與心血管疾病

乙醛脫氫酶 2(ALDH2)是線粒體內(nèi)一種重要的醛類氧化酶,在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。ALDH2野生型能夠抑制心肌細(xì)胞凋亡發(fā)揮心肌保護(hù)作用[21],是心力衰竭和心肌病的保護(hù)因子。ALDH2還是體內(nèi)重要的氧化應(yīng)激分子,ALDH2野生型能夠減少體內(nèi)的氧化應(yīng)激,減緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[22];增加斑塊的穩(wěn)定性,減少心肌梗死。提高ALDH2活性有望成為心血管疾病治療的突破點(diǎn)。

5.4 乙醛脫氫酶與神經(jīng)系統(tǒng)

人類神經(jīng) tau蛋白具有穩(wěn)定細(xì)胞微管系統(tǒng)、調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞生長發(fā)育的功能[23],并在神經(jīng)系統(tǒng)的形成和軸突的通訊傳導(dǎo)中起著至關(guān)重要的作用[24]。tau是一種磷酸化蛋白,其功能主要通過磷酸化調(diào)節(jié)。超磷酸化可導(dǎo)致 tau蛋白分子的聚集,形成配對(duì)螺旋樣纖維[25],這是老年性癡呆在病理學(xué)上的基本病變之一。乙醛可能使 tau分子錯(cuò)折疊而產(chǎn)生超磷酸化,華茜,聶春來等[26]用乙醛對(duì)人類神經(jīng) tau進(jìn)行醛胺化,通過 NCLK(neuronal cdc2-like protein kinase)和 [γ-32P]ATP對(duì)其磷酸化,磷酸化的產(chǎn)物經(jīng)胃蛋白酶降解及 HPLC(C-18)分析降解片段,發(fā)現(xiàn)醛胺化 tau的降解物中有兩個(gè)新的磷酸化肽段(A4和 A6)?？梢娂皶r(shí)降解體內(nèi)的乙醛顯得尤為重要,而開發(fā)乙醛脫氫酶類蛋白質(zhì)藥物,不失為一種好的選擇。

5.5 乙醛脫氫酶與腫瘤

長期的大量攝入乙醇會(huì)增加上消化道癌 (口腔、咽、喉和食道)、胃癌以及直腸癌的發(fā)病率。研究表明乙醛有直接的誘變和致癌性。乙醛可使得DNA發(fā)生點(diǎn)突變,從而誘導(dǎo)姐妹染色單體交換和染色體異常[27]。乙醛導(dǎo)致 DNA復(fù)制異常和削弱修復(fù)作用的一個(gè)機(jī)制就是形成穩(wěn)定的 DNA絡(luò)合物[28]。有很多流行病學(xué)研究已經(jīng)證實(shí),攜帶 ALDH2＊2等位基因的亞洲人因酗酒引發(fā)消化道癌癥的幾率明顯較大:胃癌、結(jié)腸癌、肺癌為 3～10倍;咽癌、食道癌為 11～15倍[29];而食道癌、咽癌和肺癌同時(shí)發(fā)病的幾率增加了 50倍。

5.6 乙醛脫氫酶在生理代謝方面的研究

乙醛可以共價(jià)地與微粒體蛋白結(jié)合形成乙醛蛋白絡(luò)合物。后者可以作為新抗原刺激機(jī)體引起相應(yīng)的免疫應(yīng)答,導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。乙醛可以與酶的重要功能基團(tuán)結(jié)合,導(dǎo)致酶活性改變,影響酶的功能。乙醛還可以與細(xì)胞內(nèi)微管中的管蛋白結(jié)合。微管的重要功能之一就是促進(jìn)蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌,肝內(nèi)蛋白質(zhì)分泌障礙,導(dǎo)致蛋白質(zhì)在肝內(nèi)滯留,引起肝細(xì)胞損傷。早期乙醇性肝纖維化和肝硬化形成過程中,肝星形細(xì)胞活化,導(dǎo)致肝星形細(xì)胞中的 I型膠原和纖維連接蛋白基因增加,從而引起細(xì)胞外基質(zhì)在肝內(nèi)沉積,肝纖維化形成[19,20]。

同時(shí),乙醛可與體內(nèi)一些蛋白質(zhì)、磷脂、核酸等呈共價(jià)鍵結(jié)合,形成穩(wěn)定的加合物。ALDH的生理意義在于它對(duì)乙醛的解毒作用。乙醛在肝臟和其他器官內(nèi)的氧化由 NAD+-依賴性 ALDH催化,酶促反應(yīng)是不可逆的,它以直鏈和支鏈的脂肪族和芳香族醛作為底物,產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的酮酸[30]。

5.7 乙醛脫氫酶在臨床研究上應(yīng)用

2007年 Ginestier[31]等發(fā)現(xiàn) ALDH1是乳腺癌干細(xì)胞的標(biāo)記物,此后,在白血病,視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤等多種腫瘤干細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)有ALDH1表達(dá)[32,33],ALDH1能氧化環(huán)磷酰胺的中間代謝產(chǎn)物醛磷酰胺,形成無毒的羧基磷酰胺,從而發(fā)揮對(duì) CTX的解毒作用[34],而且細(xì)胞中 ALDH1水平可以用來預(yù)測環(huán)磷酰胺治療的療效,由于ALDH1的解毒作用導(dǎo)致腫瘤對(duì)環(huán)磷酰胺的耐藥。另有研究表明,經(jīng)化療后的結(jié)直腸癌組織中腫瘤干細(xì)胞有 ALDH1的表達(dá)[35]。

國內(nèi)研究中,周凌,虞佩等[36]采用免疫組織化學(xué)染色法檢測 92例乳腺癌患者腫瘤組織中 ALDH1蛋白的表達(dá),并結(jié)合臨床病理特性進(jìn)行相關(guān)性分析和無病生存期分析,結(jié)果表明ALDH1蛋白表達(dá)陽性的乳腺癌患者其無病生存率與耐藥有關(guān),ALDH1可作為乳腺癌預(yù)后判斷的指標(biāo),可用于鑒別乳腺癌組織中的“類干細(xì)胞”群落;潘兆軍,江志敏等[37]研究發(fā)現(xiàn)ALDH1在結(jié)腸癌組織中有一定高表達(dá)率,其高表達(dá)提示預(yù)后不良,可作為評(píng)價(jià)結(jié)腸癌預(yù)后指標(biāo),促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的臨床實(shí)踐。

另有研究發(fā)現(xiàn),乙醛脫氫酶在活的造血干 /祖細(xì)胞 (HSPC)中高表達(dá),乙醛脫氫酶活性檢測可以作為檢測臍帶血中 HSPC的一個(gè)有用指標(biāo)[38],拓寬了其應(yīng)用領(lǐng)域。

6 結(jié)語

近年來,隨著生物技術(shù)日新月異的發(fā)展,對(duì)乙醛脫氫酶的研究越來越深入,研究了該酶的基因多態(tài)性、分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì),報(bào)道了該酶的誘導(dǎo)劑、激活劑、抑制劑,并對(duì)該酶分離提純,還通過基因工程將該酶基因表達(dá)在大腸桿菌和植物體內(nèi)。但研究較多集中在乙醛脫氫酶的分離提取、基因多態(tài)性以及其與疾病的相關(guān)性方面,并未見將乙醛脫氫酶制成預(yù)防和治療各種相關(guān)疾病 (像酒精性疾病)的藥品或保健品的報(bào)道,也未見其在工業(yè)上應(yīng)用的報(bào)道。

由于ALDH的廣泛作用,它必將受到研究者的日益關(guān)注。隨著新的分離純化技術(shù)出現(xiàn),ALDH將會(huì)得到更好的分離,屆時(shí)它的用武之地將會(huì)大大擴(kuò)展。

1 Todd L Kelson,et al.Human liver fatty aldehyde dehydrogenase:microsomal localization,purification,and biochemical characterization.Biochim Biophys Acta,1997,1335:99-110.

2 Kwan-Hoon Moon,et al.Inactivation of cytosolic aldehyde dehydrogenase via S-nitrosylation in ethanol-exposed rat liver.FEBS Letters,2007,581:3967-3972.

3 Yoshida A,et al.Human aldehydrogenase gene family.Eur J B iochem,1998,251:549-557.

4 Qiao HL(喬海靈).Clinical Pha rmacology,1st Ed.Zhengzhou:Zhengzhou university Press,2004.117-118.

5 Hempel J,et al.Aldehyde dehydrogenase.A lcohol,1993,25:105-116.

6 Steinmetz CG,et al.Structure of mitochondrial aldehyde dehydrogenase:the genetic component of ethanol aversion.Structure,1997,5:701-711.

7 Moore SA,et al.Sheep liver cytosolic aldehyde dehydrogenase:the structure reveals the basis foe the retinal specificity of class 1 aldehydes dehydrogenase.Structure,1998,6:1541-1551.

8 NiL,et al.Human livermitochondrial aldehyde dehydrogenase:three-d imensional structure and the restoration of solubility and activity and activity of chimeric forms.Protein Sci,1999,8:2784-2790.

9 Keith A Bostian,Grahaham F Betts.Rapid purification and properties of potassium-activated aldehyde dehydrogenase from Saccharomyces cerevisiae.Bioche mical J,1978,173:773-786.

10 Wu GY(吳桂英),et al.Study on aldehyde dehydrogenase release by breaking yeast cells.Liquor-making Science&Technology,2006,(11):21-23.

11 Zhou BL(周百靈),et al.Extraction of and research on cytosolic aldehyde dehydrogenase fromSaccharo myces cerevisiae.Liquor-making Sci Technol,2009,(6):28-30.

12 Liu QL(劉清利),et al.Breeding acetobactermutants producing aldehyde dehydrogenase and enzymatic properties.Acta Agric Boreali-occid Sin,2006,15:251-254.

13 Wang HB(王紅波),et al.Optimization of cultivation media ofAcetobacter pasteurianus for acetaldehyde dehydrogenase.Food Sci Technol,2009,34(5):6-9.

14 Wu GY(吳桂英),et al.Study on the fe rmentation conditions for aldehyde dehydrogenase production bySaccharom yces cerevisiae.Liquor-making Sci Technol,2009,(5):40-41.

15 Brunq Stellmach.Qian JY(錢嘉淵)(translation).Bestimmungsmethoden Enzyme.Beijing:ChinaLightIndustry Press,1992.36.

16 OK IB E N,et al.Gene cloning and characterization of aldehyde dehydrogenase from a petroleum-degrading bacterium Strain HD-1.J B iosci B ioeng,1999,88:7-11.

17 Crabb DW,et al.Genotype for aldehyde dehydrogenase deficiency and alcohol sensitivity.J Clin Invest,1989,83:314-316.

18 YangBS(楊保勝).et al.Medical Genetics and Reproductive Sciences.Zhengzhou:Zhengzhou University Press,2008.322.

19 Luo HR,Zhang YP.Aldehyde dehydrogenase(ALDH2)polymor phism and drinking behavior.Int J Mol Med,2000,6:455-457.

20 Surrenti C,Galli M.Molecular mechanisms of alcohol-induced liver injury.Minerva GastroenterolD ietol,2003,49:95-105.

21 Sun AJ,et al.Proteomic analysis of myocardial mitochondria in rats with heart faikure.Cardiovasc D rugs Ther,2004,18(1):21.

22 NaritaM,et al.Effects of aldehydrogenase genotypes on carotid atherosclerosis.U ltrasound Med B iol,2003,29:1415-1419.

23 Drechsel DN,et al.Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau.Mol Biol Cell,1992,3:1141-1154.

24 Brion JP,et al.Both adult and juvenile tau microtubule-associated proteins are axon specific in the developing and adult rat cerebellum.Neurosci,1988,25:139-146.

25 Beyreuther K,Masters CL.Alzheimers disease-tangle disentanglement.Nature,1996,383:476-477.

26 Hua Q(華茜),et al.Effect of acetaldehyde on phosphorylation of human neuronal tau.Prog B iochen B iophys,2001,28:761-763.

27 Dellarco VL.A mutagenicity assessmentof acetaldehyde.Mutat Res,1988,195:255-262.

28 Fang J I,Aca CE.Detection of DNA adducts of acetaldehyde in peripheral white blood cells of alcohol abusers.Carcinogenesis,1997,18:627-632.

29 Yokoyama A,et al,Alcohol-related cancers and aldehyde dehydrogenase 3 Japanese alcoholics.Carcinogenesis,1998,8:1383-1387.

30 Zhou HH(周宏灝).Genetic Pharmacology.Beijing:Science Press,2001.206.

31 Ginestier C,et al.ALDH1 is a marker of normal and malignant.human mammary stem cells and predictor of poor clinical outcome.Cell Stem Cell,2007,1:555-567.

32 MagniM,et a.lInduction of cyclophosphamide-resistance by aldehyde dehydrogenase gene transfer.B lood,1996,87:1097-1103.

33 MagniM,et a.lInduction of cyclophosphamide-resistance by aldehyde-dehydrogenase gene transfer.B lood,1996,87:1097-1103.

34 Yanagawa Y,et al.The transcriptional regulation of human aldhyde dehydrogenase I gene.The structural and functional analysis of the promoter.J B iol Chem,1995,270:17521-17527.

35 Dylla SJ,et al.Colorectal cancer stem cells are enriched in xenogeneictumors following chemotherapy.PLOS ONE,2008,3(6):24-28.

36 Zhou L(周凌),et al.Expression of aldehyde dehydrogenase1 in breast cancer and its clinical significance.Tum or,2009,29:663-667.

37 Pan ZJ(潘兆軍),et al.Expression ofALDH1 and its significance in colon cancer.Chin Gen Surg,2009,3:19-21.38 LiL(李莉 ),et al.The application of acetaldehyde dehydrogenase in detection of cord blood haemopoietic stem/progenitor cells.B ioMed Eng Clin Med,2009,13:324-327.

Research Progress of Aldehyde Dehydrogenase

MAO Gen-nian＊,L IXin,QU Jian-bo
College of life Science&Engineering,Shanxi University of Science&Technology,Xi'an,710021,China

R284.2

A

1001-6880(2011)01-0193-05

2010-03-16 接受日期:2010-06-17

陜西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (SJ08B18);陜西省教育廳專項(xiàng)科研計(jì)劃項(xiàng)目 (編號(hào) 08JK236)

＊通訊作者 E-mail:maogn@sust.edu.cn