(暨南大學(xué) 赤潮與水環(huán)境研究中心,廣東 廣州 510632)

近年來(lái),越來(lái)越多過(guò)去被認(rèn)為完全依賴光合自養(yǎng)的甲藻被證實(shí)具有吞噬功能而成為混合營(yíng)養(yǎng)生物[1-2]。吞噬營(yíng)養(yǎng)可能是甲藻一項(xiàng)重要的生理生態(tài)適應(yīng)策略,有利于甲藻在不斷變化的環(huán)境條件下保持營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì),尤其是在藻類受到光強(qiáng)或營(yíng)養(yǎng)鹽限制無(wú)法光合自養(yǎng)時(shí),吞噬營(yíng)養(yǎng)可作為獲取有機(jī)碳或主要限制性營(yíng)養(yǎng)鹽的補(bǔ)充途徑[3-5]。混合營(yíng)養(yǎng)策略在甲藻赤潮的形成及發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用,開展赤潮甲藻吞噬營(yíng)養(yǎng)行為的研究有助于深入了解赤潮甲藻的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)策略機(jī)制,解釋某些甲藻赤潮在低營(yíng)養(yǎng)鹽濃度下爆發(fā)和長(zhǎng)時(shí)間維持的機(jī)制[4-6]。

東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)、米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)和鏈狀亞歷山大藻(Alexandrium catenella)是中國(guó)東海主要的赤潮原因種[7]。本論文以人工培養(yǎng)的活體藻類和熒光標(biāo)記藻類(FLA)為餌料,研究實(shí)驗(yàn)室不同光照及營(yíng)養(yǎng)鹽條件下3種目標(biāo)甲藻的吞噬營(yíng)養(yǎng)行為,并與東海原甲藻赤潮發(fā)生現(xiàn)場(chǎng)圍隔實(shí)驗(yàn)中獲得的東海原甲藻的吞噬營(yíng)養(yǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較,分析3種赤潮甲藻的營(yíng)養(yǎng)模式,初步探討吞噬營(yíng)養(yǎng)模式對(duì) 3種赤潮甲藻獲取營(yíng)養(yǎng)的重要性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及培養(yǎng)條件

米氏凱倫藻、鏈狀亞歷山大藻、東海原甲藻及餌料藻球等鞭金藻(Isochrysis galbana)、骨條藻(Skeletonemasp.)、旋轉(zhuǎn)海鏈藻(Thalassiosira curviseriata)、亞心形四爿藻(Platymonas subcordiformis)、赤潮異彎藻(Heterosigma akashiwo)、微小原甲藻(Prorocentrum minimum)來(lái)自暨南大學(xué)赤潮與水環(huán)境研究中心藻種庫(kù)。按照低/富營(yíng)養(yǎng)鹽條件設(shè)計(jì)將目標(biāo)甲藻長(zhǎng)期用滅菌f/8或f/2培養(yǎng)基培養(yǎng),餌料藻則都用滅菌 f/2培養(yǎng)基培養(yǎng),在藻類培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)加入抗生素抑菌。培養(yǎng)條件為：光暗周期 L ：D= 12 ：12,光照 60 μE/(m2·s),溫度 20℃ ± 1 ℃。采用Retiga 4000R圖像分析系統(tǒng),按照細(xì)胞的寬度和深度相等的原則[8],根據(jù) Hillebrand[9]建立的公式計(jì)算細(xì)胞體積,并將體積轉(zhuǎn)換成單位細(xì)胞碳含量[10]。

按Rublee &Gallegos的方法制備FLA[11]。包括有熒光標(biāo)記的球等鞭金藻(FLIg)、骨條藻(FLS)及旋轉(zhuǎn)海鏈藻(FLTc),冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 有/無(wú)光照及低/富營(yíng)養(yǎng)鹽條件下3種赤潮甲藻對(duì)活體餌料藻的攝食

將3種目標(biāo)甲藻分別接種至f/2(富營(yíng)養(yǎng))及f/8(低營(yíng)養(yǎng))培養(yǎng)基中,待目標(biāo)甲藻生長(zhǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期,取10mL目標(biāo)甲藻到50 mL的錐形瓶,根據(jù)碳生物量相當(dāng)?shù)脑瓌t,分別加入一定數(shù)量處于指數(shù)生長(zhǎng)期的 3種餌料藻進(jìn)行混合培養(yǎng),若未發(fā)現(xiàn)甲藻吞噬行為,則相對(duì)提高添加的餌料藻濃度(表1)。其中一組實(shí)驗(yàn)在正常光照條件下進(jìn)行,另一組則采用黑暗培養(yǎng),每組兩個(gè)平行,4～6 h后,取一定體積的藻液,在正置熒光顯微鏡(Olympus BX61)的明場(chǎng)模式下觀察甲藻是否有攝食現(xiàn)象,并計(jì)算攝食入細(xì)胞內(nèi)的餌料藻的數(shù)目,每個(gè)樣品觀察細(xì)胞數(shù)＞200個(gè)。采用圖像分析系統(tǒng)拍攝有吞噬營(yíng)養(yǎng)行為的目標(biāo)甲藻。實(shí)驗(yàn)中,采用 DAPI(4’ 6’- diamidino- 2- phenylindole)染色樣品,在熒光顯微鏡紫外激發(fā)光波段(Ex= 306～370 nm,Em＞420 nm)下觀察,基本排除細(xì)菌的影響。

1.3 有/無(wú)光照及低/富營(yíng)養(yǎng)鹽條件下3種赤潮甲藻對(duì)FLA的攝食

取10 mL上述f/2和f/8培養(yǎng)基中培養(yǎng)的目標(biāo)甲藻到 50 mL的錐形瓶(目標(biāo)甲藻的起始濃度如表1),分別向?qū)嶒?yàn)瓶中添加FLIg、FLS和FLTc(f/2培養(yǎng)條件下餌料藻的終密度分別為2×106,0.8×106和1×106個(gè)/ mL,f/8低營(yíng)養(yǎng)條件下FLA的添加量減半),同樣設(shè)置兩組實(shí)驗(yàn),一組是在正常光照下培養(yǎng),另一組實(shí)驗(yàn)黑暗培養(yǎng),每組設(shè)兩個(gè)平行。4～6 h后,分別取一定體積的藻液,在熒光顯微鏡的明場(chǎng)及藍(lán)光波段(Ex= 460～495 nm,Em＞510 nm)下切換觀察目標(biāo)甲藻是否具有攝食行為,并計(jì)算攝食入甲藻細(xì)胞里的FLA個(gè)數(shù),觀測(cè)細(xì)胞數(shù)＞200個(gè)。實(shí)驗(yàn)中,采用DAPI染色樣品,在熒光顯微鏡紫外激發(fā)光波段下觀察,基本排除細(xì)菌的影響。

表1 實(shí)驗(yàn)藻種的體積、碳含量及起始密度Tab.1 Volume,carbon biomass,and initial concentrations of species tested

1.4 東海赤潮高發(fā)區(qū)現(xiàn)場(chǎng)船基圍隔實(shí)驗(yàn)中東海原甲藻對(duì)熒光標(biāo)記藻類的攝食

2010年春季,在東海長(zhǎng)江口鄰近海域發(fā)生了大面積的東海原甲藻赤潮。5月11日,取東海原甲藻赤潮中心區(qū)域 Rb16 測(cè)站(123°17.95′ E,30°1′ N)的表層海水進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)船基圍隔實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)周期為10天。共設(shè) 6個(gè)圍隔袋(M1～M6),每個(gè)圍隔袋水體積大約為700 L,其中M1為對(duì)照袋,M2、M3及M6在實(shí)驗(yàn)起始時(shí)一次性加入不同濃度的硝酸鹽(NO3- N)、磷酸鹽(PO4- P)和尿素,M4和M5則是每天早上8：30分次加入營(yíng)養(yǎng)鹽(如表2所示)。實(shí)驗(yàn)期間,利用水泵將現(xiàn)場(chǎng)海水抽入帆布袋內(nèi)作為循環(huán)水,以保持圍隔袋內(nèi)水溫與現(xiàn)場(chǎng)海水一致。在現(xiàn)場(chǎng)每天測(cè)定圍隔袋中的 Chla值,分別在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的第2、5和 8天(分別代表東海原甲藻藻華的指數(shù)生長(zhǎng)期、平穩(wěn)期、衰亡期)進(jìn)行東海原甲藻對(duì)FLA的攝食實(shí)驗(yàn)。

取500 mL水樣,經(jīng)120 μm篩絹過(guò)濾后分裝到3個(gè)300 mL的聚乙烯瓶中,置于現(xiàn)場(chǎng)表層海水的水浴中培養(yǎng) 30 min,使瓶中溫度接近于表層海水水溫,分別在瓶中加入 FLIg和 FLTc(終密度約為 2.0×104個(gè)/mL),另外一組不加 FLA作對(duì)照,黑暗中培養(yǎng)4 h。取20 mL樣品,依次加入魯格試劑(終濃度0.5%)、福爾馬林(終濃度 3 %)及硫代硫酸鈉溶液(終濃度0.1 %)進(jìn)行固定[12]。放在4 ℃冰箱保存4 h使細(xì)胞變硬。

表2 圍隔實(shí)驗(yàn)中添加的營(yíng)養(yǎng)鹽量Tab.2 Concentrations of nutrients added in mesocosms

在低負(fù)壓條件下將樣品過(guò)濾至8 μm孔徑的黑膜上。在樣品快過(guò)濾完時(shí),加入1 mL的DAPI,終濃度為25 mg/L,搖勻,黑暗培養(yǎng)10 min,將藻液濾干。濾膜在-20 ℃冷凍保存,帶回實(shí)驗(yàn)室鏡檢。觀察時(shí)先在熒光顯微鏡的紫外波段下確定為東海原甲藻,在藍(lán)光激發(fā)波段下觀測(cè)原甲藻是否存在吞噬FLA的現(xiàn)象。

2 結(jié)果與分析

2.1 有/無(wú)光照及低/富營(yíng)養(yǎng)鹽條件下3種赤潮甲藻對(duì)活體餌料藻的攝食

無(wú)論是在富營(yíng)養(yǎng)的 f/2培養(yǎng)基還是低營(yíng)養(yǎng)的 f/8培養(yǎng)基,也無(wú)論是正常光照條件還是黑暗條件,在添加入活體餌料藻的4～6 h后,在顯微鏡下觀測(cè)到3種目標(biāo)甲藻的生理活性良好,在顯微鏡視野下快速游動(dòng)。

在不同培養(yǎng)條件的實(shí)驗(yàn)組中,分別跟蹤觀測(cè)混合培養(yǎng)的 3種目標(biāo)甲藻的攝食行為。但僅在富營(yíng)養(yǎng)的f/2及正常光照條件下,觀測(cè)到1個(gè)游動(dòng)中的米氏凱倫藻細(xì)胞內(nèi)部攝食有 2個(gè)球等鞭金藻,在黑暗及低營(yíng)養(yǎng)條件下未發(fā)現(xiàn)目標(biāo)甲藻有吞噬營(yíng)養(yǎng)行為,表明米氏凱倫藻具有吞噬營(yíng)養(yǎng)行為,但發(fā)生攝食的概率極低,是一偶然現(xiàn)象。增大餌料藻的密度,未觀測(cè)到3種目標(biāo)甲藻的吞噬營(yíng)養(yǎng)行為。

2.2 有/無(wú)光照及低/富營(yíng)養(yǎng)鹽條件下3種赤潮甲藻對(duì)FLA的攝食

無(wú)論是何種培養(yǎng)條件,添加入 FLIg、FLS和FLTc的4～6 h后,在顯微鏡下觀測(cè)到東海原甲藻、鏈狀亞歷山大藻和米氏凱倫藻在視野下快速游動(dòng),表明生理狀態(tài)良好。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),富營(yíng)養(yǎng)的 f/2培養(yǎng)基條件下,鏈狀亞歷山大藻在正常光照及黑暗下均有攝食FLTc的現(xiàn)象,觀察＞200個(gè)細(xì)胞,僅各觀測(cè)到1個(gè)游動(dòng)的鏈狀亞歷山大藻細(xì)胞攝食2～3個(gè)FLTc,表明攝食概率低。實(shí)驗(yàn)中未觀測(cè)到鏈狀亞歷山大藻對(duì)FLIg和FLS的攝食,也未觀測(cè)到東海原甲藻或米氏凱倫藻對(duì)FLA的任何攝食。

低營(yíng)養(yǎng)的 f/8培養(yǎng)基中,無(wú)論是正常光照還是黑暗條件下,均未觀測(cè)到3種目標(biāo)甲藻對(duì)FLA的攝食。

圖1 游動(dòng)中的米氏凱倫藻攝食活體球等鞭金藻Fig.1 A swarming Karenia mikimotoi ingested two live Isochrysis galbana

圖2 熒光顯微鏡下鏈狀亞歷山大藻對(duì)熒光標(biāo)記海鏈藻的攝食Fig.2 The ingestion of fluorescent labeled Thalassiosira curviseriata by Alexandrium catenella under epifluorescence microscopy

2.3 東海赤潮高發(fā)區(qū)現(xiàn)場(chǎng)船基圍隔實(shí)驗(yàn)中東海原甲藻對(duì)FLA的攝食

實(shí)驗(yàn)早期,6個(gè)圍隔袋中均發(fā)現(xiàn)東海原甲藻對(duì)FLIg的攝食;而僅在未添加營(yíng)養(yǎng)鹽的 M1和每天僅添加微量營(yíng)養(yǎng)鹽的 M4中,發(fā)現(xiàn)東海原甲藻對(duì) FLS具有攝食(表3)。東海原甲藻攝食FLIg的數(shù)量為1～4個(gè),而一般只攝食1個(gè)FLS(圖3),這可能與多數(shù)骨條藻為長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu),較難吞噬有關(guān)。在觀測(cè)的500個(gè)細(xì)胞中,僅 2～7個(gè)東海原甲藻細(xì)胞具有攝食行為,攝食概率0.4%～1.4 %。

而在實(shí)驗(yàn)的中后期,即東海原甲藻藻華的發(fā)展及衰亡階段,各圍隔袋中均未觀測(cè)到東海原甲藻的攝食行為。

表3 圍隔實(shí)驗(yàn)中東海原甲藻對(duì)熒光標(biāo)記藻類的攝食Tab.3 Feeding occurrences of Prorocentrum donghaiense on fluorescent labeled Isochrysis galbana (FLIg) and Skeletonema sp.(FLS)

圖3 熒光顯微鏡下東海原甲藻對(duì)熒光標(biāo)記金藻(a)和骨條藻(b)的攝食Fig.3 The ingestion of fluorescent labeled Isochrysis gallbana (a) and Skeletonema sp.(b) by Prorocentrum donghaiense under epifluorescence microscopy

3 討論

在室內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,首次發(fā)現(xiàn)米氏凱倫藻對(duì)球等鞭金藻,鏈狀亞歷山大藻對(duì)旋轉(zhuǎn)海鏈藻具有攝食行為;且通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)船基圍隔實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)東海原甲藻在赤潮發(fā)生時(shí),對(duì)熒光標(biāo)記的球等鞭金藻和骨條藻具有攝食行為,這一結(jié)果豐富了赤潮甲藻的吞噬營(yíng)養(yǎng)行為的研究。此前,尚未見米氏凱倫藻吞噬營(yíng)養(yǎng)行為方面的任何報(bào)道。有研究認(rèn)為鏈狀亞歷山大藻具有食物泡結(jié)構(gòu)且能攝食細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌等原核生物,為混合營(yíng)養(yǎng)生物[13-14],但報(bào)道鏈狀亞歷山大藻攝食真核生物尚屬首次。東海原甲藻和中肋骨條藻是東海海區(qū)的兩個(gè)重要的赤潮藻種[15-16],Yoo等[17]在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)發(fā)現(xiàn),東海原甲藻能攝食中肋骨條藻(Skeletonema costatum)。本文首次在東海原甲藻赤潮發(fā)生現(xiàn)場(chǎng),觀測(cè)到東海原甲藻對(duì)球等鞭金藻和骨條藻的攝食。

Jeong的研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為,多數(shù)自養(yǎng)甲藻都可能具有吞噬營(yíng)養(yǎng)的行為和能力,且這種吞噬行為非常普遍[17-18]。其研究結(jié)果表明,處于指數(shù)生長(zhǎng)期的東海原甲藻、海洋原甲藻在富營(yíng)養(yǎng)的f/2條件下對(duì)中肋骨條藻的攝食率可分別達(dá)到 0.5和 3.1 cells/(dinoflagellate·d)[17]。然而,從本室內(nèi)研究發(fā)現(xiàn),無(wú)論是在黑暗或是在營(yíng)養(yǎng)鹽脅迫的條件下,3種目標(biāo)甲藻的攝食概率都非常低。雖然不排除目標(biāo)甲藻對(duì)餌料藻的種類及粒徑的選擇性問題[19-20](本文選取不同門類、易被攝食的較小粒徑及海區(qū)常見種類),本研究結(jié)果認(rèn)為目標(biāo)甲藻雖具有吞噬營(yíng)養(yǎng)的行為及能力,但主要還是依賴光合自養(yǎng)方式獲取營(yíng)養(yǎng)鹽。也可能存在一種解釋就是,在室內(nèi)長(zhǎng)期富營(yíng)養(yǎng)和光照充足的培養(yǎng)條件下,目標(biāo)甲藻的吞噬營(yíng)養(yǎng)能力已經(jīng)減弱甚至喪失,造成實(shí)驗(yàn)中對(duì)甲藻吞噬行為及其重要性的低估。

圍隔實(shí)驗(yàn)中東海原甲藻攝食概率數(shù)據(jù)支持了室內(nèi)研究的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)前期,東海原甲藻可以攝食FLIg和 FLS,但是發(fā)生攝食的概率僅達(dá)到 0.4%～1.4 %,表明即使在營(yíng)養(yǎng)鹽脅迫的條件下,光合自養(yǎng)仍然是東海原甲藻主要獲取營(yíng)養(yǎng)鹽的方式。有趣的是,在圍隔實(shí)驗(yàn)的中后期,東海原甲藻在營(yíng)養(yǎng)鹽脅迫加重的情況下,卻未發(fā)生攝食行為,該原因是否與不同生長(zhǎng)時(shí)期東海原甲藻具有不同的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)模式及策略,或一旦進(jìn)入人工培養(yǎng)狀態(tài)甲藻即喪失吞噬營(yíng)養(yǎng)行為有關(guān),尚有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

在富營(yíng)養(yǎng)的正常光照條件下,觀測(cè)到 1個(gè)米氏凱倫藻攝食球等鞭金藻;在富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)的正常光照及黑暗條件下,各觀測(cè)到 1個(gè)鏈狀亞歷山大藻攝食旋轉(zhuǎn)海鏈藻。2010年5月,在東海原甲藻赤潮發(fā)生現(xiàn)場(chǎng)的船基圍隔實(shí)驗(yàn)中,前期發(fā)現(xiàn)東海原甲藻能攝食球等鞭金藻及骨條藻,但發(fā)生攝食的概率也僅為0.4%～1.4%,且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)吞噬行為消失。該研究結(jié)果表明,雖然東海原甲藻、米氏凱倫藻和鏈狀亞歷山大藻具有吞噬營(yíng)養(yǎng)行為,為混合營(yíng)養(yǎng)生物。但無(wú)論是在黑暗或是營(yíng)養(yǎng)饑餓的條件下,3種目標(biāo)藻發(fā)生吞噬營(yíng)養(yǎng)的概率都非常低,是屬于主要依賴光合自養(yǎng)獲取營(yíng)養(yǎng)的種類。

致謝：現(xiàn)場(chǎng)圍隔實(shí)驗(yàn)獲得國(guó)家海洋局第一海洋研究所孫萍老師的大力幫助,在此表示誠(chéng)摯感謝。

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