蘆 珂，廖婷彬

（1.四川省雅安職業(yè)技術(shù)學院藥學檢驗系，四川 雅安 625000；2.四川養(yǎng)麝研究所，四川 都江堰 611800）

本試驗觀察了天府肉鴨采食含銅100mg/kg以上的高銅日糧時紅細胞免疫功能的動態(tài)變化，旨在揭示銅對紅細胞免疫功能的影響規(guī)律，同時初步探討了高銅對紅細胞免疫功能的影響機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和日糧

1.1.1 試驗動物 選用1日齡天府肉鴨健雛300只隨機分成6組，每組50只（其中30只定期剖殺作血液生化指標的動態(tài)觀察），平均體重為52～60g/只。各組雛鴨分別飼養(yǎng)于木制實驗禽籠內(nèi)，自由采食，飲用去離子水。管理方式與常規(guī)育雛一致，試驗期為6周。

1.1.2 試驗日糧 玉米－豆粕型基礎日糧（含Cu 8 mg/kg）作為對照組日糧，在對照組日糧中分別添加Cu 92mg/kg、192 mg/kg、392 mg/kg、592 mg/kg、792 mg/kg構(gòu)成高銅日糧I組（Cu 100mg/kg）、II組（Cu 200mg/kg）、Ⅲ組（Cu 400mg/kg）、Ⅳ組（Cu 600mg/kg）、Ⅴ組（Cu 800mg/kg）。其中蛋白質(zhì)含量、能量以及維生素和微量元素（銅除外）添加量均參照肉鴨NRC（1994）的營養(yǎng)標準。銅源為CuSO4·5H2O晶體(飼料級)。試驗日糧組成和營養(yǎng)成分詳見表1。

1.2 紅細胞免疫功能測定 于試驗的第7d、35d，從各組隨機抽取4只肉鴨作頸靜脈采血，肝素鈉抗凝，用紅細胞C3b花環(huán)和紅細胞免疫復合物（IC）花環(huán)實驗來檢測紅細胞的免疫功能（郭峰，1982）。測定用的凍干酵母菌購于上海某醫(yī)院免疫室。

表1 試驗日糧組成和營養(yǎng)成分

1.3 RBC－C3bRR實驗 取新鮮肝素抗凝全血0.1～0.5 mL，加等量生理鹽水稀釋，用Ficoll分離液水平離心除去其他血細胞。取沉底的紅細胞，用生理鹽水洗3次，每次2000r/min離心5min。記數(shù)后配成每1mL含1.25×108個細胞的紅細胞懸液。將洗滌3次后的1%酵母懸液經(jīng)定性濾紙過濾，恢復原體積，煮沸20min。充分混勻洗滌2次，使其在低倍顯微鏡下呈單個細胞分散狀態(tài)。加等量鴨血清，37℃水浴15min，用生理鹽水混勻，洗滌，離心1次，配成1×108個/mL C3b致敏酵母懸液。用5號針頭滴管取紅細胞懸液5滴，加C3b致敏酵母懸液2滴，在試管內(nèi)充分混勻，37℃水浴30min，加10滴生理鹽水稀釋混勻，再加0.25%戊二醛2滴固定，涂片，冷風吹干，用瑞氏－姬姆薩染液染色，鏡檢。鏡下酵母菌呈淡藍色，紅細胞呈紅色，白細胞呈深藍色。高倍鏡或油鏡下計數(shù)200個紅細胞，紅細胞黏附2個或2個以上的酵母菌為一個花環(huán)形成細胞，計數(shù)算出花環(huán)陽性細胞百分率，即為紅細胞免疫黏附活性指標。

1.4 RBC－ICR實驗 心血提取紅細胞同上，煮沸酵母菌同上，但不加鴨血清致敏。5滴紅細胞懸液加5滴煮過的酵母菌，搖勻，置37℃水浴30min，取出用適量的生理鹽水混勻后，再加0.25%戊二醛2滴搖勻，水平涂片，固定，染色。鏡下計數(shù)，以紅細胞黏附2個或2個以上酵母為一個花環(huán)形成細胞，計數(shù)200個紅細胞，算出花環(huán)陽性細胞百分率，即為RBC－IC花環(huán)率（ICR）。

1.5 數(shù)據(jù)處理 用SPSS統(tǒng)計軟件分析測定結(jié)果，確定組間差異顯著性。

2 結(jié)果

紅細胞C3bR花環(huán)和IC花環(huán)的形態(tài)如下圖所示：

2.1 紅細胞C3bR花環(huán)率變化 1周齡時，各試驗組隨銅劑量升高C3bR花環(huán)率不同程度地依次降低，對照組的C3bR花環(huán)率最高，其中3個高銅試驗組（Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ）與對照組比較差異極顯著（P＜0.01）。5周齡時，Ⅰ組C3bR花環(huán)率低于第Ⅱ組，其余各試驗組的C3bR花環(huán)率隨著銅劑量的升高而降低，Ⅴ組與對照組比較差異顯著（P＜0.05）。詳情見表2，圖1。

表2 雛鴨紅細胞C3bR花環(huán)率 %

表3 雛鴨紅細胞IC花環(huán)率 %

2.2 紅細胞IC花環(huán)率變化 1周齡時，各試驗組隨銅劑量升高IC花環(huán)率不同程度地依次降低，對照組的IC花環(huán)率最高，其中第Ⅴ組與對照組比較差異極顯著（P＜0.01），Ⅳ組與對照組比較差異顯著（P＜0.05）。5周齡時，各試驗組的IC花環(huán)率隨著銅劑量的升高呈先升高后降低的態(tài)勢，Ⅰ組與Ⅲ組比較差異顯著（P＜0.05）。

3 討論與結(jié)論

3.1 本試驗結(jié)果表明，高銅可導致雛鴨C3bR花環(huán)率下降，且飼料中銅的含量越高，C3bR花環(huán)率的下降輻度越大。說明當飼料中銅含量超過200mg/kg后，RBCCR1花環(huán)率與飼料銅含量之間存在著負相關。根據(jù)紅細胞C3bR花環(huán)和IC花環(huán)的形成原理（在花環(huán)形成前還處于未結(jié)合狀態(tài)的CR1在C3bR花環(huán)形成過程中發(fā)揮作用），說明此結(jié)果反映了紅細胞上處于未結(jié)合狀態(tài)的CR1數(shù)量，而CR1是先通過C3b與IC結(jié)合，處于結(jié)合狀態(tài)后，連接于CR1的C3b再與酵母菌黏連形成IC花環(huán)，故IC花環(huán)率顯示了結(jié)合狀態(tài)的CR1數(shù)目。

3.2 本試驗結(jié)果表明，高銅導致雛鴨紅細胞IC花環(huán)率1周齡時降低；5周齡時，隨著飼料銅劑量的升高，IC花環(huán)率先升高后降低。Forslod（1982）認為，紅細胞內(nèi)含有高濃度過氧化氫酶及超氧化物歧化酶，能清除吞噬過程中產(chǎn)生的氧化代謝產(chǎn)物，從而促進吞噬作用。筆者認為，在巨噬細胞吞噬紅細胞上免疫復合物（IC）的過程中所產(chǎn)生的自由基，不僅僅只依賴于紅細胞內(nèi)過氧化物酶的清除，作為清除紅細胞上IC的主要場所，肝、脾內(nèi)過氧化物酶活性的改變同樣會影響巨噬細胞功能的正常發(fā)揮，使其不能將IC有效清除，因此IC花環(huán)率升高。本研究中IC花環(huán)率升高的結(jié)果提示：高銅可能導致雛鴨肝脾等參與紅細胞上IC清除的主要器官的功能出現(xiàn)異常。

有報道指出，紅細胞的免疫功能同時受紅細胞免疫調(diào)節(jié)因子、白介素等細胞因子和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)等多種因素的影響，因此高銅對紅細胞免疫黏附能力的影響機制可能更為復雜，有待進一步深入探討。缺銅對動物生長發(fā)育和免疫功能的影響已引起了廣泛關注，目前高銅添加劑越來越受到人們青睞，且添加量有越來越多之勢，以致銅在畜禽機體組織中的殘留到了令人擔憂的地步。本試驗結(jié)果表明，飼料銅含量在200mg/kg即可導致紅細胞免疫功能下降，所以補銅必須慎重，防止過量補銅對動物機體產(chǎn)生毒副作用。

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