孫 超，謝達(dá)平

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

隨著全球化石能源的日益枯竭和環(huán)境污染的惡化，生物丁醇作為一種生物能源和重要化工原料以其新型、潔凈、可再生等特點(diǎn)開始受到人們的高度重視[1]。就傳統(tǒng)的丙酮丁醇發(fā)酵而言，依然存在著菌種耐受有機(jī)溶劑能力低、丁醇產(chǎn)量、產(chǎn)率低等缺點(diǎn)[2]。針對(duì)傳統(tǒng)丙酮丁醇發(fā)酵中存在以上問題，以發(fā)酵菌種的改良為主要目的，采用分子生物學(xué)手段、基因工程及代謝工程來提高丁醇的產(chǎn)量已成為研究的熱點(diǎn)。

丙酮丁醇發(fā)酵的主要菌種是丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum），是一種革蘭氏陽(yáng)性、細(xì)胞呈梭狀、能產(chǎn)生丙酮、丁醇和乙醇(3∶6∶1，w/w)溶劑的厭氧芽孢桿菌。丙酮丁醇梭菌細(xì)胞代謝過程中，通過解除代謝過程中各種可能的中間產(chǎn)物的抑制，調(diào)控強(qiáng)化各種關(guān)鍵酶，如丁醛脫氫酶（BAD）、乙酰乙酸脫羧酶（AADC）、乙酰乙酰-CoA：乙酸/丁酸∶CoA 轉(zhuǎn)移酶（CoAT）、丁醇脫氫酶（BDH）等，對(duì)加強(qiáng)丁醇的合成代謝，提高丁醇的產(chǎn)量具有重要的意義[3-4]。其中丁醇脫氫酶BDH（EC 1.1.99.8）作為丁醇代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一，直接影響到最終產(chǎn)物丁醇產(chǎn)量的高低。丁醇脫氫酶是一種誘導(dǎo)酶，在產(chǎn)溶劑階段酶活力達(dá)到最高[5]，其分子量為82±2 kDa，由兩個(gè)分子量都為42 kDa的同工酶（Ⅰ和Ⅱ）組成，其中BDHⅠ作用于丁醇合成初期，BDHⅡ作用于丁醇濃度較高的時(shí)期，根據(jù)對(duì)輔酶的依賴性可分為依賴NADH的BDH和依賴NADPH的BDH[6-9]，該菌株中依賴NADH的BDH在國(guó)內(nèi)未見報(bào)道，為此，本文研究了丙酮丁醇梭菌發(fā)酵過程中依賴NADH的BDH的分離純化，旨在為丙酮丁醇梭菌代謝途徑的調(diào)控提供一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種 丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum），中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC）保存，菌種編號(hào)1.0133。

1.1.2 試劑及儀器 供試試劑為NADH，L-半胱氨酸，正丁醛，硫酸銨等。儀器為超聲波破碎儀，紫外分光光度計(jì)，冷凍離心機(jī)，恒溫培養(yǎng)箱，冷凍干燥機(jī)等。

1.1.3 培養(yǎng)基 （1）活化培養(yǎng)基：玉米粉2%，蛋白胨0.05%，葡萄糖0.2%，L-半胱氨酸0.05%，硫代乙醇酸鈉0.02%。過40目篩的玉米粉需煮沸60min，pH調(diào)至6.8，分裝于厭氧管中，裝液量5 mL,于121℃滅菌20min。（2）種子培養(yǎng)液：葡萄糖4%，牛肉膏0.2%，酵母膏0.2%，蛋白胨0.6%，乙酸銨0.3%，K2HPO40.05%，MgSO40.02%，F(xiàn)eSO40.001%，pH調(diào)至6.5，分裝于帶硅膠塞的厭氧瓶中，裝液量60mL,于 121℃滅菌 20min。（3）發(fā)酵培養(yǎng)基：同種子培養(yǎng)液，分裝于厭氧瓶中，裝液量150 mL，于121℃滅菌20min。

1.2 方 法

1.2.1 菌種活化與發(fā)酵培養(yǎng) 從保存的丙酮丁醇梭菌斜面上挑取一環(huán)細(xì)菌接種于新鮮的活化培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)48 h。從已經(jīng)產(chǎn)生氣體的活化培養(yǎng)基中吸取0.5 mL菌液接種于種子培養(yǎng)液，35℃靜置培養(yǎng)24 h，再取種子培養(yǎng)液以5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，35℃靜置培養(yǎng)48 h。

1.2.2 丁醇脫氫酶粗酶液的制備 細(xì)胞培養(yǎng)約48 h，檢測(cè)是否有代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，若有則置于冰浴中停止培養(yǎng)，5 000 r/min，4℃，離心10min收集細(xì)胞。蒸餾水洗滌2次，測(cè)定細(xì)胞濕重，并以1:3的比例用 0.1 mol/L Tris-HCl（含 0.1mmol/L DTT）pH 7.5的緩沖液使細(xì)胞重懸。細(xì)胞重懸液置于冰浴中，超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，功率20W，10 min,間歇10 s。細(xì)胞破碎液經(jīng) 10 000 r/min，4℃，離心 10min，所得上清液即為粗酶液，4℃?zhèn)溆肹10]。

1.2.3 丁醇脫氫酶酶活測(cè)定 對(duì)細(xì)胞粗酶液測(cè)定BDH酶活可通過（1）式進(jìn)行反應(yīng)換算：

通過測(cè)定NADH在340 nm下的降低量從而測(cè)定丁醇脫氫酶酶活。反應(yīng)體系為：3mL 0.01mol/L Tris-HCl，pH 6.0緩沖液中含2 mmol/L丁醛，0.5 mmol/LNADH及50μL酶液[11]。加入丁醛之前，含有酶液的反應(yīng)體系先于35℃水浴中平衡30min，然后補(bǔ)加適當(dāng)?shù)腘ADH，再加入底物丁醛，35℃反應(yīng)10 min，迅速置于冰浴中5min,終止反應(yīng)，在340 nm下比色，計(jì)算NADH在340 nm下讀數(shù)的降低值，空白對(duì)照用等體積的去離子水替代底物丁醛[12]。酶活力單位定義：每1min NADH的OD值下降0.001為1個(gè)酶活力單位[13]。

1.2.4 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定 用考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法測(cè)定蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度[14]。

1.2.5 丁醇脫氫酶的分離純化 將研細(xì)的（NH4）2SO4按照20%的飽和度加入到粗酶液中，4℃下靜置1 h，再在10 000 r/min下離心30min，棄去沉淀（沉淀為初步分離的雜蛋白），取上清液加硫酸銨至60%飽和度，4℃下靜置1 h后10 000 r/min下離心30 min，棄去上清液，沉淀用10 mmol/L pH 6.4的磷酸鹽緩沖液溶解[15]。取上述酶液2mL，以0.5mL/min的流速進(jìn)行Sephadex G-75凝膠層析，分部收集洗脫液，每管收集4 mL，在280 nm下測(cè)定各管OD值，并測(cè)定各部分活性[16]。

1.2.6 丁醇脫氫酶的SDS-PAGE分析 將經(jīng)過硫酸銨沉淀及Sephadex G-75凝膠層析后具有酶活的酶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)[17-18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離純化結(jié)果及分析

丁醇脫氫酶純化結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明經(jīng)過2次硫酸銨沉淀，硫酸銨飽和度為60%，可除去部分非蛋白質(zhì)雜質(zhì)，酶比活力由20.21 U/mg提高到33.14 U/mg，純化倍數(shù)為1.64。再經(jīng)過Sephadex G-75凝膠層析進(jìn)一步純化，通過分子篩作用酶比活力提高到256.7 U/mg，純化倍數(shù)為12.7。

表1 丙酮丁醇梭菌中丁醇脫氫酶的純化

2.2 Sephadex G-75柱色譜洗脫曲線

將收集到的洗脫液分別測(cè)定280 nm下的蛋白濃度和具有蛋白峰管數(shù)的酶活，其結(jié)果如圖1。結(jié)果表明蛋白濃度在第12，16和23管分別出現(xiàn)三個(gè)峰，其中第16管峰值最大，而具有丁醇脫氫酶活性的出現(xiàn)在第18～20管，將其冷凍干燥保存?zhèn)溆?，作為電泳鑒定分析。

圖1 Sephadex G-75凝膠層析曲線圖

2.3 SDS-PAGE電泳鑒定分析

將每步純化收集的具有酶活的組分進(jìn)行SDSPAGE，結(jié)果見圖2。在42.0 kDa附近出現(xiàn)了一條帶，與報(bào)道的目的蛋白結(jié)果相符。

圖2 SDS-PAGE電泳分析丁醇脫氫酶

2.4 丁醇脫氫酶酶學(xué)性質(zhì)研究

2.4.1 粗酶液中丁醇脫氫酶的穩(wěn)定性 按照1.2.3方法在有氧狀態(tài)下每24 h測(cè)定粗酶液中丁醇脫氫酶的活力，觀察保存于4℃下丁醇脫氫酶的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖3。丁醇脫氫酶在10 d后其活力下降至初始活力的30%。

圖3 丁醇脫氫酶的穩(wěn)定性

2.4.2 丁醇脫氫酶的最適反應(yīng)溫度 按照1.2.3中的方法，分別取 20、25、30、35、40、45、50℃下測(cè)定其酶活，結(jié)果見圖4。由圖4可以看出在35℃下丁醇脫氫酶的活力達(dá)到最高值，其最適反應(yīng)溫度為35℃。

圖4 溫度對(duì)丁醇脫氫酶的影響

2.4.3 丁醇脫氫酶的最適反應(yīng)pH值 按照1.2.3中的方法，在35℃下，將緩沖液的pH值分別調(diào)制4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 并測(cè)定其酶活，結(jié)果見圖5。由圖5可以看出丁醇脫氫酶在pH為6.0的時(shí)候達(dá)到最高值，但是酶受pH的影響并不顯著。

圖5 pH值對(duì)丁醇脫氫酶的影響

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從丙酮丁醇梭菌中分離純化了依賴NADH的丁醇脫氫酶，經(jīng)過硫酸銨沉淀和Sephadex G-75凝膠層析，酶比活力達(dá)到256.7 U/mg，純化倍數(shù)為12.7，回收率為28.9%，丁醇脫氫酶在有氧狀態(tài)下保存10 d酶活力為初始酶活的30%，其最適反應(yīng)溫度是35℃，最適反應(yīng)pH是6.0。由于細(xì)胞內(nèi)有關(guān)丁醇代謝途徑的關(guān)鍵酶含量不高，且易氧化失活，胞外反應(yīng)體系構(gòu)建中其它酶和天然底物與NADH存在耦聯(lián)反應(yīng)，給酶活測(cè)定造成一定的難度。本文將丁醇脫氫酶酶活測(cè)定方法進(jìn)行適當(dāng)改良從而避免其它酶和天然底物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果所帶來的影響。

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