雷 婷,劉理禮,韓 霜,郭雪艷,丁 杰

1.蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院消化病中心,新疆烏魯木齊 830000;2.第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院腫瘤科;3.第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院消化病院全軍消化病研究所腫瘤生物學國家重點實驗室;4.陜西省人民醫(yī)院消化內(nèi)科

缺氧是實體瘤普遍存在的現(xiàn)象,多年來,人們對腫瘤組織缺氧重要性的認識來源于一個事實,缺氧細胞對治療具有固有的耐受性。近年來不斷有文獻報道在例如結腸癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、睪丸癌等多種腫瘤細胞對阿霉素、鉑劑、絲裂霉素和環(huán)磷酰胺等化療藥物發(fā)生了耐藥[1-3]。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧能夠顯著降低胃癌細胞對于多種化療藥物的敏感性,其主要是通過上調(diào)藥物轉(zhuǎn)運蛋白的表達及增加抗凋亡分子Bcl-2/Bax的比例實現(xiàn)的。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人胃癌細胞系SGC7901引自軍事醫(yī)學科學院。鼠抗人p-gp、MRP、Bcl-2和Bax單克隆抗體購自Santa Cruz公司。細胞培養(yǎng)用1640培養(yǎng)液(Gibco公司),胎牛血清(浙江杭州四季青公司。RTPCR試劑盒(Promega),缺氧培養(yǎng)箱:Forma Scientific公司(1%O2,5%CO2,94%N2)。

1.2 M TT比色法 將待檢細胞預先缺氧(1%O2)或常規(guī)培養(yǎng) 8 h,將化療藥物按不同濃度加入各孔細胞,繼續(xù)缺氧或常規(guī)培養(yǎng)48 h;MTT呈色后,選擇490 nm波長比色,計算胃癌細胞在缺氧和常氧條件下化療藥物不同濃度下的存活率。細胞存活率(%)=(實驗組A值-空白對照組A值)/(陰性對照組A值-空白對照組A值)×100%。IC50的計算以細胞存活率為縱軸,藥物濃度對數(shù)為橫軸作半對數(shù)圖,并按作圖法求出胃癌細胞黏附于不同成分后對兩種藥物的 IC50值。

1.3 Annexin V/PI染色法 收獲對數(shù)生長期的待檢細胞,細胞貼壁后加入VCR,劑量為2.5 mg/L,37℃缺氧或常氧培養(yǎng)48 h;加入5μL的Annexin V-FITC后收集細胞,PI染液,流式細胞儀分析。計算細胞的凋亡指數(shù):細胞凋亡指數(shù)=(早期凋亡細胞數(shù)+晚期凋亡細胞數(shù))/總細胞數(shù)×100%。

1.4 阿霉素蓄積潴留實驗 收獲對數(shù)生長中期的待檢細胞,按照每孔 1×105個細胞接種于6孔板中;培養(yǎng)過夜后,缺氧或常氧培養(yǎng)12 h后每孔加入ADR至終濃度為5mg/L,繼續(xù)培養(yǎng)1 h;收獲細胞上流式細胞儀檢測細胞內(nèi)的ADR熒光強度,計算藥物的泵出率:細胞藥物泵出率(%)=(阿霉素的蓄積量-阿霉素的潴留量)/阿霉素的蓄積量×100%。

1.5 W estern blot 提取不同時間暴露于缺氧的胃癌細胞SGC7901的總蛋白,一抗分別為p-gp、MRP、Bcl-2和Bax單克隆抗體分別缺氧不同時間的蛋白水平的變化。

1.6 半定量RT-PCR 利用細胞總RNA提取試劑Trizaol提取細胞的總RNA,共20μL的反應體積用于1～2μg總RNA的反轉(zhuǎn)錄反應,cDNA產(chǎn)物于-20℃保存。半定量PCR引物根據(jù)MDR1、MRP、Bcl-2、Bax和β-actin mRNA序列用Primer Primere 5軟件設計。引物由上海英駿生物工程公司合成,序列如下:上游引物5′-AACGGAAGCCAGAACATTCC-3′,下游引物5′-AGGCTTCCTGTGGCAAAGAG-3′(MDR1);上游引物5′-ATACCTGCTGTTCGGATTT-3′,下游引物5′-CGC ATAGTGGATGGCTTT-3′(MRP-1);上游引物5′-AGGATTGTGGCCTTCTTTGAG-3′,下游引物5′-GAGACAGCCAGGAG AAATCAAA-3′(Bcl-2);上游引物5′-CAGGATCGAGCAGGGCGAATG-3′下游引物5′-GCTTGAGGAGTCTCACCCAACCA-3′(Bax);上游引物5′-ATCCTGCCAGTAGCATATGC-3′,下游引物5′-ACCGGGTTGGTTTTGATCTG-3′(β-actin)。PCR反應條件94℃40 s,57℃40 s,72℃1min,70℃10min,30個循環(huán)。

1.7 統(tǒng)計學分析 根據(jù)數(shù)據(jù)不同,相應采用配對 t檢驗、方差分析及Dunnett's多均數(shù)比較等方法,使用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件完成數(shù)據(jù)處理。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 缺氧對于化療藥物敏感性的影響

2.1.1 MTT比色法檢測常氧狀態(tài)下和缺氧狀態(tài)下的胃癌細胞SGC7901對于化療藥物5-氟尿嘧啶(5-Fu)和長春新堿(VCR)等5種化療藥物的藥物敏感性:缺氧狀態(tài)下胃癌細胞對 5種化療藥物的敏感性均明顯低于常氧狀態(tài)下的胃癌細胞,提示缺氧能夠顯著降低化療藥物的敏感性(P＜0.05,見表1)。

表1 SGC 7901在缺氧和常氧條件下對 5種化療藥物的IC50 (μg/m L,±s)Tab 1 IC 50 of chemotherapeutic d rugs under normoxic and hypoxic condition in SGC 7901 cells(μg/m L,±s)

與常氧狀態(tài)下的SGC7901的IC50相比,*P＜0.05

化療藥物常氧狀態(tài)(IC50)缺氧狀態(tài)(IC50) 耐藥指數(shù)5-Fu 2.16±0.86 8.92±1.13* 4.1±0.13 VCR 1.23±0.01 6.23±0.15* 5.1±1.51 CDDP 3.23±1.18 7.51±1.03* 2.3±0.33 VP16 4.43±1.59 12.09±3.46* 2.7±0.11 ADM 0.33±0.22 0.72±0.19* 2.1±0.91

2.1.2 Annexin V/PI染色法借助流式細胞儀檢測胃癌細胞SGC7901在常氧和缺氧狀態(tài)下對于化療藥物誘導下的凋亡情況:常氧狀態(tài)下VCR誘導SGC7901的凋亡指數(shù)為44.7%,而在缺氧條件下,VCR誘導SGC7901細胞的凋亡指數(shù)下降了 20.7%,差異具有顯著的統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。而未加VCR的兩組細胞中常氧和缺氧狀態(tài)下的細胞凋亡指數(shù)無顯著性差異。提示缺氧能夠增加胃癌細胞抵抗化療藥物誘導的凋亡能力(見圖1)。

2.1.3 流式細胞儀(FCM)檢測常氧狀態(tài)和缺氧狀態(tài)下胃癌細胞SGC7901內(nèi)阿霉素的蓄積和潴留,并計算相應的藥物泵出率:與常氧狀態(tài)下相比,缺氧條件下的SGC7901細胞內(nèi)阿霉素蓄積和潴留均明顯減少,藥物泵出率顯著增加(見表2)。

表2 胃癌細胞的阿霉素蓄積潴留和藥物泵出率(±s)Tab 2 Accumu lation and retention of Adriam ycin in SGC 7901 cells under normoxic and hypoxic condition(±s)

表2 胃癌細胞的阿霉素蓄積潴留和藥物泵出率(±s)Tab 2 Accumu lation and retention of Adriam ycin in SGC 7901 cells under normoxic and hypoxic condition(±s)

與常氧狀態(tài)下的SGC7901細胞的泵出率相比,*P＜0.05

熒光強度蓄積 潴留 泵出率SGC7901(N)6.34±0.51 5.47±0.23 0.14±0.04 SGC7901(H)5.04±0.48 3.76±0.33 0.25±0.03*

圖1 SGC 7901細胞在常氧和缺氧下VCR誘導的凋亡指數(shù)Fig 1 Apoptosis index induced by VCR under normoxic and hypoxic condition in SGC 7901 cells

2.2 缺氧上調(diào)MDR和MRP的表達 通過Western blot檢測不同時間缺氧處理的SGC7901細胞中藥物轉(zhuǎn)運蛋白p-gp和MRP的表達,結果顯示(見圖2A):與常氧狀態(tài)下的SGC7901細胞相比,在缺氧培養(yǎng)8 h后細胞內(nèi)的p-gp和MRP蛋白水平明顯增加,具有顯著的統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。

半定量RT-PCR檢測不同時間處理的SGC7901細胞中MDR1和MRP1的mRNA水平,結果發(fā)現(xiàn)(見圖2B):與常氧狀態(tài)下相比,缺氧能夠明顯上調(diào)細胞內(nèi)MDR1和MRP1的mRNA水平。

圖2 M DR和MRP在常氧和缺氧條件下的表達Fig 2 Exp ression o f MDR and M RP under normoxic and hypoxic condition

2.3 缺氧增加抗凋亡分子 Bcl-2和降低促凋亡分子Bax的表達 通過Western blot檢測不同時間缺氧處理的SGC7901細胞中凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax的表達,結果顯示(見圖 3A):與常氧狀態(tài)下的細胞相比, SGC7901細胞在缺氧培養(yǎng)4 h后,抗凋亡分子Bcl-2的蛋白水平呈時間依賴性的增加,并在缺氧 8 h后達到高峰,差異具有顯著的統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而凋亡相關分子Bax的表達在缺氧2 h后明顯下降,且隨著缺氧時間的延長,Bax的表達也逐漸下降。

半定量RT-PCR檢測不同時間處理的SGC7901細胞中Bcl-2和Bax的mRNA水平,結果發(fā)現(xiàn)(見圖3B):與常氧狀態(tài)下的細胞相比,缺氧能夠明顯上調(diào)Bcl-2mRNA水平,下調(diào)Bax mRNA水平,且變化趨勢與蛋白水平一致。

圖3 Bcl-2和Bax在缺氧和常氧條件下的表達Fig 3 Expression of Bcl-2 and Bax under normoxic and hypoxic condition

3 討論

早在 20世紀七、八十年代,研究人員就發(fā)現(xiàn)在暴露于缺氧條件下或缺氧應激后,腫瘤細胞對阿霉素、鉑劑和環(huán)磷酰胺等化療藥物發(fā)生耐藥[4]。而后研究者相繼在不同腫瘤組織和細胞中發(fā)現(xiàn),缺氧會增加腫瘤細胞對化療藥物的耐受。Kinoshita等[5]研究發(fā)現(xiàn),缺氧可以增加結腸癌細胞對化療藥物的抗凋亡能力,促進腫瘤細胞的生存。另有文獻報道,在睪丸癌細胞[6]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[7]、胰腺癌[8]缺氧均可以降低化療藥物的療效。我們的研究發(fā)現(xiàn),在胃癌細胞SGC7901中,缺氧顯著增加了 5-氟脲嘧啶、長春新堿、順鉑等 5種化療藥物的藥物敏感性,尤其是對于 5-氟尿嘧啶和長春新堿的耐受更為顯著。

多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)是指腫瘤細胞同時對多種化學結構和作用機理并不相同的藥物產(chǎn)生的耐受性。p-gp(ABCB1)是第一個被確定可介導多藥耐藥現(xiàn)象的藥物轉(zhuǎn)運蛋白,也是研究最廣泛深入的一個成員,是ABC(ATP binding cassette family)超家族的成員,研究證實 p-gp高表達或活性增強可降低藥物在細胞內(nèi)的蓄積,導致MDR。MDR1基因的誘導表達取決于細胞類型:多種誘導劑在不同的細胞中以不同的方式影響該基因的活性。例如,射線照射過的中國倉鼠細胞對長春新堿耐藥,其機制可能與翻譯或翻譯后調(diào)節(jié)有關[9]?；瘜W致癌劑誘導大鼠肝細胞 MDR1基因活性增強,再生大鼠肝細胞進行部分肝切除后也產(chǎn)生同樣的作用[10]。某些細胞因子在特定類型的培養(yǎng)細胞中誘發(fā)ABCB1-MDR現(xiàn)象。熱休克和細胞分化誘導劑也會影響 MDR1基因的活性。近年來發(fā)現(xiàn)缺氧能夠誘導一些腫瘤細胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運蛋白的基因表達,參與了缺氧誘導的MDR。

Katrina等[11]用RNA定量微陣分析顯示,缺氧后上皮細胞中MDR1增加了7倍;而且缺氧條件下p-gp功能較常氧增強(7±0.4)倍;并證實MDR1基因上存在HIF-1的結合位點。從而進一步證實MDR1是缺氧反應基因。Wartenberg等[12]發(fā)現(xiàn)缺氧時p-gp在肝癌細胞中表達增高,氧化劑 H2O2和丁硫氨酸亞礬胺降低p-gp的表達,而自由基清除劑N-乙酰半胱氨酸和維生素E則增加了p-gp的表達,提示缺氧可誘導p-gp的表達。缺氧可以通過對 MDR1的轉(zhuǎn)錄激活參與腫瘤細胞的多藥耐藥。

但是,也有兩個實驗室報道,在乳腺癌和結腸癌細胞中缺氧誘導了化療藥物的抵抗,但缺氧并無改變pgp和MRP的表達水平,提示缺氧導致的化療誘導的抵抗存在細胞特異性[13,14]。我們的研究發(fā)現(xiàn),在胃癌細胞中,缺氧能夠增加MDR1基因及其產(chǎn)物p-gp的表達,降低化療藥物在胃癌細胞中的潴留和蓄積,從而部分誘導胃癌細胞的MDR。除此以外,我們還發(fā)現(xiàn)缺氧還能夠增加另外一個藥物轉(zhuǎn)運蛋白MRP1的表達。提示,在胃癌細胞中,缺氧誘導的 MDR表型部分通過增加p-gp和MRP的表達,從而降低了化療藥物在細胞內(nèi)的蓄積。

另外,缺氧可以降低化療藥物誘導的凋亡,主要是通過上調(diào)抗凋亡分子的表達或是降低凋亡分子的表達,從而降低化療藥物的殺傷效能。而在此過程中,文獻報道,缺氧能夠抑制凋亡分子Bid的表達,降低依托泊甙對于結腸癌細胞的殺傷效能。在口腔鱗狀上皮癌細胞中,缺氧通過抑制Caspase-9和Caspase-3的活性以及增加抗凋亡分子Bcl-2和Bcl-X(L)的表達從而抑制凋亡的發(fā)生。但是,缺氧還存在著促進細胞凋亡的效應。Moritz等[15]發(fā)現(xiàn)人和小鼠胰島β細胞缺氧6 h即出現(xiàn)核固縮,Caspase-3表達增高;研究還發(fā)現(xiàn)缺氧能夠誘導胰島素瘤細胞系(MIN6)凋亡比例增加。缺氧還可激活促凋亡分子RTP801、NIX、NIP3[16],由此引起細胞凋亡。

在凋亡的發(fā)生機制中,凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bcl-2及其家族成員在其中起著重要的作用。Bcl-2與Bax的比例調(diào)節(jié)了凋亡的發(fā)生[17]。我們的研究發(fā)現(xiàn),在胃癌細胞中,缺氧4 h后能夠明顯上調(diào)抗凋亡分子Bcl-2的表達,缺氧2 h后能夠明顯下調(diào)促凋亡分子 Bax的表達,因此,我們推測,在胃癌細胞 SGC7901中,缺氧通過增加抗凋亡分子Bcl-2/Bax的比例抑制了化療藥物誘導的凋亡,從而介導胃癌細胞的MDR。眾所周知,缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是缺氧活化的一個重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,可以通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控多種靶基因來維持腫瘤細胞在缺氧條件下的生存。有研究證實缺氧上調(diào)p-gp的表達是通過HIF-1轉(zhuǎn)錄活化MDR1基因的機制調(diào)節(jié)的,那么在胃癌細胞中我們發(fā)現(xiàn)的缺氧上調(diào)的MRP、Bcl-2是否也是通過HIF-1轉(zhuǎn)錄活化的還有待于進一步的研究。

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