劉培 張向紅 胡振生 孫善珍 劉少華 魏奉才

（1.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院 整形外科； 2.山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院 組織胚胎學(xué)教研室；

3.山東大學(xué)口腔醫(yī)院 病理科；4.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院 口腔科研究室，濟(jì)南 250012）

沉默DNA結(jié)合抑制蛋白-1基因?qū)ο贅幽倚园┘?xì)胞生長(zhǎng)和侵襲能力的影響

劉培1張向紅2胡振生1孫善珍3劉少華4魏奉才4

（1.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院 整形外科； 2.山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院 組織胚胎學(xué)教研室；

3.山東大學(xué)口腔醫(yī)院 病理科；4.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院 口腔科研究室，濟(jì)南 250012）

目的 探討DNA結(jié)合抑制蛋白-1（Id-1）基因在腺樣囊性癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲行為中的作用。方法 以涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC-M和ACC-2為研究對(duì)象，免疫熒光檢測(cè)Id-1基因的表達(dá)；用小干擾RNA進(jìn)行Id-1基因的RNA干擾；于干擾前后應(yīng)用RT－PCR和Western blot檢測(cè)2個(gè)細(xì)胞系Id-1表達(dá)情況；于干擾前后應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及用Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果 在ACC-M和ACC-2中，Id-1均有表達(dá)，ACC-M表達(dá)量高于ACC-2；通過(guò)RNA干擾沉默Id-1基因后，ACC-M和ACC-2的生長(zhǎng)和侵襲能力均受到抑制。在受抑制程度上，ACC-M比ACC-2更為強(qiáng)烈。結(jié)論 鑒于Id-1對(duì)ACC細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲行為的重要影響，干擾Id-1基因的表達(dá)，有望成為治療腺樣囊性癌新的有效方法之一。

DNA結(jié)合抑制蛋白-1； 腺樣囊性癌； 增殖； 侵襲

腺樣囊性癌（adenoid cystic carcinoma，ACC）是發(fā)生于頭頸部涎腺最常見的惡性腫瘤，約占所有惡性腫瘤20%[1]，具有高度的侵襲和轉(zhuǎn)移特性[2]。由于對(duì)ACC生物學(xué)性質(zhì)認(rèn)識(shí)上的局限性，目前尚無(wú)很有效的治療措施，即使進(jìn)行了廣泛的手術(shù)切除及放射治療，大多數(shù)患者最終還是出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[3]。臨床上急需尋求治療ACC的新方法。

DNA結(jié)合抑制蛋白（inhibitor of DNA binding，Id）屬于螺旋-環(huán)-螺旋（helix-loop-helix，HLH）轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族，在細(xì)胞生長(zhǎng)和分化方面具有廣泛的調(diào)節(jié)作用。Id蛋白有4個(gè)家族：Id-1、Id-2、Id-3、 Id-4，目前研究[4-5]發(fā)現(xiàn)：Id-1與人類多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系。然而在ACC中，Id-1的表達(dá)量如何，其對(duì)ACC的生長(zhǎng)和侵襲能力的影響尚不得而知。

ACC-M和ACC-2分別是涎腺腺樣囊性癌肺高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株和低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株，本研究通過(guò)檢測(cè)其Id-1基因的表達(dá)，以及Id-1 RNA干擾前后2個(gè)細(xì)胞系的生長(zhǎng)和侵襲能力的變化，探討Id-1基因?qū)CC的生長(zhǎng)和侵襲能力的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC-M（購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心），ACC-2（山東大學(xué)齊魯醫(yī)院腫瘤中心實(shí)驗(yàn)室凍存）；DMEM（Gibco公司，美國(guó)），opti-MEM（Invitrogen公司，美國(guó)），胎牛血清（Gibco公司，美國(guó)），脂質(zhì)體Lipofectamine2000（Invitrogen公司，美國(guó)），兔抗鼠Id-1抗體（SC-488，Santa Cruz公司，美國(guó)），F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔抗體（Southern Biotech公司，美國(guó)），Id-1 siRNA（Invitrogen公司，美國(guó)），噻唑藍(lán)（Sigma公司，美國(guó)）；BioCoat Matrigel侵襲小室（24孔，8μm，Becton Dickinson公司，美國(guó)），LSM710激光掃描共聚焦顯微鏡（Zeiss公司，德國(guó)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC-M和ACC-2解凍復(fù)蘇，于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、37℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中密閉培養(yǎng)。不加入青霉素和鏈霉素。

1.3 RNA干擾

應(yīng)用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）沉默Id-1基因。ACC-M和ACC-2分別分為4組：空白對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組、序列錯(cuò)配siRNA組和Id-1siRNA組。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為每孔1×105個(gè)接種于6孔板，在含10%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)基換成無(wú)胎牛血清的opti-MEM，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿底面積的50%時(shí)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。每孔加入100 pmol Id-1 siRNA和5μL lipofectamine2000。Id-1（NM_002165）siRNA序列：5’-UGAGUAACAGCCGUUCAUGUCGUAG-3’，5’-CUACGACAUGAACGGCUGUUACUCA-3’。

1.4 免疫熒光確認(rèn)干擾成功

制備單細(xì)胞來(lái)源細(xì)胞爬片，0.01 mol·L-1PBS清洗5min×3次；2.5mL·L-1TritonX-100處理15min；PBS振洗5min×3次。正常羊血清封閉。一抗滴加1∶150稀釋的兔抗鼠Id-1抗體，4℃濕盒過(guò)夜，37℃復(fù)溫1 h，PBS振洗5min×3次；分別滴加1∶50稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗，37℃孵育1 h，PBS振洗5min×2次，蒸餾水振洗1次，用500mL·L-1無(wú)熒光緩沖液甘油封片，陰性對(duì)照用PBS代替一抗，其余步驟不變。使用激光掃描共聚焦顯微鏡（激發(fā)波長(zhǎng)488 nm）進(jìn)行觀察和定量檢測(cè)。

1.5 RNA干擾前后的RT-PCR和Western blot檢測(cè)

1.5.1 總RNA的提取及RT-PCR擴(kuò)增 用Trizol常規(guī)提取ACC-M和ACC-2細(xì)胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。采用高保真Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列見表1。擴(kuò)增條件為：95℃5min，94℃ 40 s,56℃ 40 s，72℃ 40 s，36個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，分離得到的條帶用計(jì)算機(jī)圖像分析軟件進(jìn)行。

表1 引物序列以及PCR產(chǎn)物大小Tab 1 Primer sequences and size of PCR products

1.5.2 Western blot檢測(cè)ACC-M和ACC-2細(xì)胞RNA干擾前后Id-1蛋白的表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)72 h以后常規(guī)方法提取細(xì)胞總蛋白。灌制15%的SDS-PAGE凝膠，每孔上樣20mg，電泳分離，轉(zhuǎn)膜。2%BSA室溫封閉1 h；一抗室溫孵育1 h（其中兔抗鼠Id-1一抗質(zhì)量濃度為1 g·mL-1，β-actin以1∶5 000稀釋）；用TBST洗3遍；二抗室溫孵育1 h（抗兔IgG 1∶1 000稀釋）；TBST洗3遍。最后用化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)信號(hào)，條帶強(qiáng)度應(yīng)用圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.6 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

接種上述細(xì)胞于96孔板，接種密度為每毫升5×104個(gè)，每孔接種0.2mL，轉(zhuǎn)染24、48、72 h后，應(yīng)用MTT比色法于570 nm處測(cè)定吸光度A值，描記細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，每組設(shè)6個(gè)樣本。

1.7 細(xì)胞侵襲性

50mg·L-1Matrigel 1∶8稀釋液包被Transwell小室底部，4℃風(fēng)干。上室加入含有1×104個(gè)細(xì)胞的100μL DMEM，下室加入含有條件培養(yǎng)基作為趨化因子的600μL DMEM，孵育20 h以后，取出Transwell小室，PBS淋洗，用棉簽擦去微孔膜上層的細(xì)胞，95%乙醇固定，蘇木素染色。在200倍倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)移至微孔膜下層的細(xì)胞。每個(gè)樣本計(jì)數(shù)6個(gè)視野。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

測(cè)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和ANOVA檢驗(yàn)。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光檢測(cè)Id-1表達(dá)

干擾前，ACC-M和ACC-2均表達(dá)Id-1，其中ACC-M表達(dá)量遠(yuǎn)高于ACC-2（圖1）。干擾后，ACCM和ACC-2的Id-1表達(dá)量均明顯下降，而ACC-M的下降量尤為顯著（圖1）。Id-1 siRNA組均與空白對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組以及序列錯(cuò)配組有顯著差異（均為P＜0.01），空白對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組和序列錯(cuò)配組之間并無(wú)顯著差異（均為P＞0.05）。

2.2 RT-PCR和Western blot檢測(cè)RNA干擾前后Id-1表達(dá)

RT-PCR和Western blot結(jié)果見圖2。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到的Id-1mRNA水平和Western blot檢測(cè)到的Id-1蛋白水平結(jié)果一致：干擾前，ACC-M和ACC-2均表達(dá)Id-1，ACC-M表達(dá)量遠(yuǎn)高于ACC-2；干擾后，ACC-M和ACC-2的Id-1表達(dá)量均明顯下降，而ACC-M的下降量尤為顯著。Id-1 siRNA組與空白對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組以及序列錯(cuò)配組有顯著差異（均為P＜0.01），空白對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組和序列錯(cuò)配組間無(wú)顯著差異（均為P＞0.05）。

2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

干擾前，ACC-M和ACC-2均正常生長(zhǎng)，其中ACC-M生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)快于ACC-2。干擾后，ACC-M和ACC-2的生長(zhǎng)速度均明顯減慢，而ACC-M的減慢尤為顯著（圖3）。Id-1 siRNA組均與空白對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組以及序列錯(cuò)配組有差異，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.01），空白對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組和序列錯(cuò)配組之間相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＞0.05）。

2.4 細(xì)胞侵襲性

干擾前，ACC-M和ACC-2均具有侵襲性，其中ACC-M侵襲性遠(yuǎn)大于ACC-2（圖4）。干擾后，ACCM和ACC-2的侵襲性均明顯減小，而ACC-M的減小尤為顯著（圖4）。Id-1 siRNA組均與空白對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組以及序列錯(cuò)配組有差異，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.01），空白對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組和序列錯(cuò)配組之間相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＞0.05）。

圖3 ACC-M和ACC-2細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig 3 The cell proliferation curves of ACC-Mand ACC-2 cells

圖4 ACC-M和ACC-2細(xì)胞Transwell侵襲能力檢測(cè)Fig 4 Invasive ability of ACC-MandACC-2 cells detected by Transwell

3 討論

Id蛋白屬于HLH蛋白質(zhì)超家族，相對(duì)分子質(zhì)量為13 000～20 000，它是一組缺乏堿性DNA連接結(jié)構(gòu)域的HLH因子。bHLH蛋白二聚體的形成是DNA與E盒（CANNTG）或N盒（CACNAG）識(shí)別序列結(jié)合的必要條件，Id蛋白通過(guò)與bHLH轉(zhuǎn)錄因子形成異型二聚體，干擾其與DNA的結(jié)合，阻斷其對(duì)下游分子的轉(zhuǎn)錄激活作用，抑制基因的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的正常分化，促進(jìn)細(xì)胞增殖[4]。Id-1是人類迄今為止發(fā)現(xiàn)的4個(gè)Id蛋白家族成員中研究最多，也是最重要的一個(gè)。研究發(fā)現(xiàn)：Id-1在上皮來(lái)源的腫瘤中呈高表達(dá)，它通過(guò)抑制細(xì)胞正常分化、推進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程、誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、抑制衰老、誘導(dǎo)侵襲、參與腫瘤性血管新生而介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[6-9]；在大腸癌、食管癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中都發(fā)揮著重要的作用[10-14]。

ACC是口腔頜面部常見的涎腺惡性腫瘤，其臨床生物學(xué)行為突出特征之一是易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率高達(dá)40%以上[1-2]。ACC-M（涎腺腺樣囊性癌肺高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株）和ACC-2（涎腺腺樣囊性癌肺低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株）這2種細(xì)胞為同一親本，二者的差異集中在轉(zhuǎn)移表型上，轉(zhuǎn)移性具有顯著差異，ACC-M轉(zhuǎn)移率為96%，ACC-2轉(zhuǎn)移率為18%[15]。追其本源，ACC-M細(xì)胞株是由ACC-2細(xì)胞株單克隆培養(yǎng)而來(lái)，前者的增殖能力和侵襲能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于后者。本研究發(fā)現(xiàn)：ACC-M中Id-1的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ACC-2，提示Id-1的表達(dá)量與ACC-M和ACC-2增殖和侵襲能力的差別是成正相關(guān)的，即Id-1表達(dá)的不同可能造成ACC-M和ACC-2增殖和侵襲能力的不同。

以往研究發(fā)現(xiàn)的與腫瘤相關(guān)的Id-1信號(hào)通路有很多，有Akt介導(dǎo)的Wnt、p53和NF-kappa B、PI3K/ Akt/NF-kappa B和Erk/MAPK信號(hào)通路[16-19]等。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：正常涎腺組織中Id-1的表達(dá)量非常低（甚至難以檢測(cè)到），但是在涎腺腺樣囊性癌中卻呈現(xiàn)高表達(dá)，這說(shuō)明Id-1表達(dá)水平的升高可能打破了正常細(xì)胞內(nèi)癌基因與抑癌基因相互制約的平衡關(guān)系，進(jìn)而激活某條或多條信號(hào)傳導(dǎo)通路推進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而誘導(dǎo)正常細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增加通過(guò)淋巴管道和血道向周圍淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處器官侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)。

本研究發(fā)現(xiàn)：在ACC-M和ACC-2中，Id-1均有表達(dá)，ACC-M表達(dá)量高于ACC-2；通過(guò)RNA干擾沉默Id-1基因后，ACC-M和ACC-2生長(zhǎng)均受到抑制，ACC-M比ACC-2受到更強(qiáng)烈的抑制；同樣，通過(guò)RNA干擾沉默Id-1基因后，ACC-M和ACC-2侵襲能力均受到抑制，ACC-M比ACC-2受到更強(qiáng)烈的抑制。其機(jī)制可能是通過(guò)沉默Id-1基因，腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC-M和ACC-2本來(lái)呈現(xiàn)高表達(dá)的Id-1出現(xiàn)低表達(dá)或者無(wú)表達(dá)，本來(lái)被打破了的癌基因與抑癌基因相互制約的平衡關(guān)系恢復(fù)了正常，激活了的某些信號(hào)傳導(dǎo)通路得到抑制或者關(guān)閉，抑制細(xì)胞周期進(jìn)程、促進(jìn)細(xì)胞分化、抑制細(xì)胞增殖，抑制了通過(guò)淋巴管道和血道向周圍淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處器官侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)。但是Id-1對(duì)ACC生長(zhǎng)和侵襲起調(diào)節(jié)作用的精確信號(hào)傳導(dǎo)通路，還有待進(jìn)一步的研究與探討。

本研究表明：應(yīng)用siRNA沉默Id-1基因，可以顯著抑制ACC-M和ACC-2細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲。提示干擾Id-1基因的表達(dá)，可能有望成為治療腺樣囊性癌新的有效方法。

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（本文編輯 湯亞玲）

Effects of silencing inhibitor of DNA binding-1 gene on the grow th and invasiveness of adenoid cystic carcinoma cells

LIU Pei1,ZHANG Xiang-hong2,HU Zhen-sheng1,SUN Shan-zhen3,LIU Shao-hua4,WEI Feng-cai4.（1.Dept.of Plastic Surgery,Qilu Hospital,Shandong University,Jinan250012,China；2.Dept.of Histology and Embryology,School of Medicine,Shandong University,Jinan250012,China；3.Dept.of Pathology,School of Stomatology,Shandong University,Jinan250012,China；4.Research Section of Stomatology,Qilu Hospital,Shandong University,Jinan250012,China）

ObjectiveTo investigate the role of inhibitor of DNA binding-1（Id-1）gene in adenoid cystic carcinoma cell growth and invasion behavior.MethodsWith salivary adenoid cystic carcinoma cell lines ACC-Mand ACC-2,dedected Id-1 gene expression was screened with immunofluorescence assay.After Id-1 mRNA knockingdown using small interfering RNA,RT-PCR and Western blot were used to detect the different expressions before and after interference,and the growth of cells before and after interference was deceted using the MTT assay,and the cell invasion ability was checked with the use of Transwell chamber assay.Results Id-1 were both expressed in the ACC-Mand ACC-2,and the expression in ACC-M was higher than that in ACC-2.After Id-1 RNA interference,the growth and invasiveness of ACC-Mand ACC-2 were inhibited with the restrained degree in ACC-M much stronger than that in the ACC-2.ConclusionIn view of the important role of Id-1 in the behavior of growth and invasion in ACC cell,interfering the expression of Id-1 gene is expected to be a novel and effective means for the treatment of adenoid cystic carcinoma.

inhibitor of DNA binding-1； adenoid cystic carcinoma； proliferation； invasion

R 739.87

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.01.016

1000－1182（2011）01－0066-05

2009-11-25；

2010-03-02

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30672339）；教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目（2007）

劉培（1982—），女，山東人，博士

劉少華，Tel：0531-82169247