李斌龍 謝曉莉 彭解英 羅小良 靳路遠(yuǎn)

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 口腔內(nèi)科，長沙 410008）

大蒜素對尼古丁致人牙周膜成纖維細(xì)胞氧化毒性的保護(hù)作用

李斌龍 謝曉莉 彭解英 羅小良 靳路遠(yuǎn)

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 口腔內(nèi)科，長沙 410008）

目的 研究大蒜素對尼古丁所致人牙周膜成纖維細(xì)胞（HPDLCs）氧化毒性的保護(hù)作用。方法 1）建立尼古丁對HPDLCs氧化毒性的模型，采用水溶性四氮唑（WST）比色法選出可有效抑制HPDLCs存活率的尼古丁質(zhì)量濃度X，用于后續(xù)實驗。2）將體外培養(yǎng)的第5代HPDLCs分為空白組、尼古丁組、尼古丁+大蒜素組（大蒜素質(zhì)量濃度分別為15、30、60μg·mL-1），以不同培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，采用WST比色法選出可顯著改善HPDLCs存活率的大蒜素質(zhì)量濃度Y用于后續(xù)實驗。3）將體外培養(yǎng)的第5代HPDLCs分為空白組、尼古丁組、尼古丁+大蒜素組，分別于培養(yǎng)1、4、8、12、24 h后測量細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（GSH）濃度。結(jié)果 0.8mg·mL-1尼古丁即可顯著抑制HPDLCs存活率（細(xì)胞存活率為空白組的77%，P＜0.05，取X為0.8mg·mL-1）；而60μg·mL-1大蒜素可顯著改善此負(fù)性作用，將細(xì)胞存活率提升至尼古丁組的112%（P＜0.05），且與空白組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），取Y為60μg·mL-1。在培養(yǎng)后的各時間點(diǎn)，尼古丁+大蒜素組GSH濃度與空白組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），但較尼古丁組均有明顯提高（P＜0.05）；培養(yǎng)8 h時，尼古丁+大蒜素組GSH濃度與尼古丁組相比差異最大，前者較后者提高82%。結(jié)論 60μg·mL-1大蒜素可以顯著降低尼古丁對HPDLCs的氧化損傷作用。

人牙周膜成纖維細(xì)胞； 尼古??； 氧化毒性； 大蒜素； 谷胱甘肽

吸煙是牙周病的重要危險因素。煙草中的尼古丁可以對人牙周膜成纖維細(xì)胞（human periodontal ligament cells，HPDLCs）產(chǎn)生劑量相關(guān)的氧化毒性[1-2]，促進(jìn)牙周病的發(fā)生和發(fā)展。大蒜素是從大蒜中提取的天然抗氧化劑，已用于治療口腔潰瘍和難治性根尖周炎等疾病[3]。目前，關(guān)于大蒜素是否可抑制尼古丁氧化毒性作用的研究還較少，本實驗即對此進(jìn)行研究，以便為大蒜素用于牙周病的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

尼古?。⊿igma公司，美國）、大蒜素針劑（山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司）、DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）、胎牛血清（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所），96孔及6孔培養(yǎng)板（Corning公司，美國），細(xì)胞培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀，水溶性四氮唑-1（water-soluble tetrazolium，WST-1）試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）、谷胱甘肽（glutathion，GSH）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 實驗方法

1.2.1 HPDLCs的培養(yǎng)和鑒定 取12～18歲正畸患者因治療需要而拔除的前磨牙，按照司徒鎮(zhèn)強(qiáng)組織塊培養(yǎng)法[4]進(jìn)行HPDLCs的原代與傳代培養(yǎng)。取狀態(tài)良好的第5代細(xì)胞行免疫組織化學(xué)ABC法波形絲蛋白和角蛋白染色，DAB顯色進(jìn)行鑒定。

1.2.2 尼古丁氧化毒性模型的建立 取狀態(tài)良好的第5代HPDLCs以細(xì)胞密度為每毫升5×104個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200μL，培養(yǎng)24 h后棄原培養(yǎng)基。空白組加入DMEM培養(yǎng)基200μL，5個尼古丁組分別加入尼古丁質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg·mL-1的培養(yǎng)基200μL，另設(shè)調(diào)零組，每組5復(fù)孔。培養(yǎng)20 h后每孔加10μL WST-1液，混勻繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出，于酶標(biāo)儀450 nm處讀取各組吸光度值A(chǔ)。根據(jù)公式：細(xì)胞存活率=調(diào)零后待測組A值/調(diào)零后空白組A值×100%，來計算得出各尼古丁組HPDLCs的存活率。取存活率與空白組有統(tǒng)計學(xué)差異的尼古丁組質(zhì)量濃度用于后續(xù)試驗（設(shè)該質(zhì)量濃度為X）。

1.2.3 WST比色法檢測大蒜素對尼古丁氧化毒性的影響 取狀態(tài)良好的第5代HPDLCs接種于3塊96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基。每板左側(cè)設(shè)尼古丁組5孔（3板分別為N1、N2、N3組），每孔加入尼古丁質(zhì)量濃度為X的培養(yǎng)基200μL；中份設(shè)尼古丁+大蒜素組5孔（分別為A1、A2、A3組），每孔加入培養(yǎng)基200μL（尼古丁質(zhì)量濃度均為X，且A1、A2、A3組大蒜素質(zhì)量濃度依次為15、30、60μg·mL-1）；右側(cè)設(shè)空白組5孔（C1、C2、C3組），加入培養(yǎng)基200μL；每板均另設(shè)調(diào)零組5孔。培養(yǎng)20 h后每孔加10μL WST-1液，混勻繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出，讀取各組的吸光度值A(chǔ)并計算得出各組HPDLCs存活率。取細(xì)胞存活率與同板尼古丁組有統(tǒng)計學(xué)差異的尼古丁+大蒜素組的大蒜素質(zhì)量濃度用于后續(xù)試驗（設(shè)該質(zhì)量濃度為Y）。

1.2.4 尼古丁和大蒜素共同作用后不同時間點(diǎn)的HPDLCs中GSH濃度的測定 取同步生長的第5代HPDLCs以細(xì)胞密度為每毫升6×104個細(xì)胞接種于15塊6孔板，分尼古?。∟）板、尼古丁+大蒜素（A）板、空白（C）板各5板，每孔2mL，培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基。N板每孔加入尼古丁質(zhì)量濃度為X的培養(yǎng)基2mL，A板每孔加入尼古丁質(zhì)量濃度為X且大蒜素質(zhì)量濃度為Y的培養(yǎng)基2mL，C板每孔加入普通培養(yǎng)基2mL。繼續(xù)培養(yǎng)，分別于1、4、8、12、24 h取出N、A、C板各1塊，將每板中上下相對2孔的細(xì)胞收集于同一1.5mL離心管內(nèi)，每管加300μL生理鹽水，吹打均勻后加細(xì)胞裂解液100μL，混勻后按照GSH試劑盒說明進(jìn)行后續(xù)操作，測定各組GSH的濃度。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對各實驗中每組測定數(shù)值的均值進(jìn)行方差分析，采用LSD檢驗比較組間的差異，檢驗水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HPDLCs的培養(yǎng)和鑒定

細(xì)胞培養(yǎng)5～10 d后，有扁平或長梭狀細(xì)胞從組織塊中游出，細(xì)胞核較大，呈橢圓形，細(xì)胞漿透明，有明顯的細(xì)胞分叉。電鏡下可見細(xì)胞內(nèi)有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體和發(fā)達(dá)的高爾基復(fù)合體。約20 d后，細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿底的80%。

傳代后的細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生改變，生長速度加快。經(jīng)傳代2～3次后，細(xì)胞逐漸自然純化。細(xì)胞波形絲蛋白染色陽性，細(xì)胞漿呈棕黃色著色；角蛋白染色陰性：說明培養(yǎng)的細(xì)胞是中胚層來源的成纖維細(xì)胞。

2.2 尼古丁對HPDLCs的氧化毒性

尼古丁作用24 h后，各組吸光度值A(chǔ)及細(xì)胞存活率見表1。如表1所示：除0.1mg·mL-1組外，各組HPDLCs存活率均低于空白組，且5組細(xì)胞存活率隨著尼古丁質(zhì)量濃度的增加而降低。0.8、1.6mg·mL-1組細(xì)胞存活率分別為空白組的77%和32%，其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。為防止過低的細(xì)胞存活率給后續(xù)實驗帶來假陰性誤差，本研究選取X= 0.8mg·mL-1。

2.3 大蒜素對尼古丁氧化毒性作用的影響

不同質(zhì)量濃度大蒜素及尼古丁作用后各組吸光度值A(chǔ)與HPDLCs存活率見表2。如表2所示：A1、A2組細(xì)胞存活率雖略高于同板尼古丁組，但其差異無統(tǒng)計學(xué)意義。A3組HPDLCs存活率為N3組的112%，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。A1、A2組細(xì)胞存活率分別為同板空白組的81%、80%，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而A3組細(xì)胞存活率與C3組接近，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究的后續(xù)實驗選用大蒜素的質(zhì)量濃度Y=60μg·mL-1。

表1 不同質(zhì)量濃度尼古丁作用24 h后各組吸光度值A(chǔ)及細(xì)胞存活率Tab 1 The absorptiometries（A）and the survival rate after the 24 h culture with nicotine of different concentrations

表2 不同質(zhì)量濃度大蒜素及尼古丁作用24 h后各組吸光度值A(chǔ)及細(xì)胞存活率Tab 2 The absorptiometries（A）and the survival rate after the 24 h culture with allicin and nicotine of different concentrations

2.4 尼古丁和大蒜素共同作用后不同時間點(diǎn)HPDLCs中GSH濃度

尼古丁和大蒜素共同作用后不同時間點(diǎn)HPDLCs中GSH濃度的測量結(jié)果見表3。組間比較：各時間點(diǎn)N組GSH濃度均低于A組和C組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而A組和C組的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。培養(yǎng)8 h時，N組GSH濃度達(dá)到最低，僅為C組的52%，而A組濃度較N組升高82%。組內(nèi)比較：N組GSH濃度呈現(xiàn)“先降后升再降”的趨勢，且每相鄰2個時間點(diǎn)的濃度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而A和C組各時間點(diǎn)間GSH濃度無明顯變化（P＞0.05）。

表3 尼古丁和大蒜素共同作用后各時間點(diǎn)HPDLCs中GSH濃度Tab 3 The GSH concentrations in HPDLCs at time points after the culture of nicotine and allicin μmol·L-1

3 討論

在對牙周病的研究中，尼古丁對HPDLCs的氧化損傷已經(jīng)引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。研究[5]發(fā)現(xiàn)：吸煙后牙周局部的尼古丁質(zhì)量濃度可達(dá)1.6mg·mL-1。尼古丁會使細(xì)胞內(nèi)的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）陡增，消耗GSH等抗氧化物質(zhì)[2]，從而啟動凋亡信號，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[6]。本研究旨在探討大蒜素這一抗氧化劑是否能改善尼古丁對HPDLCs的氧化毒性，為臨床采用大蒜素治療牙周病提供依據(jù)。參考其他學(xué)者[7-8]的實驗，本研究確定大蒜素的質(zhì)量濃度為15、30、60μg·mL-1。

WST-1是MTT的升級產(chǎn)品，其原理與傳統(tǒng)MTT法相似，但擁有更高的靈敏度和更寬的線性范圍。WST比色法的細(xì)胞存活率計算公式為：細(xì)胞存活率=調(diào)零后待測組A值/調(diào)零后空白組A值×100%，此公式與傳統(tǒng)的MTT法所用公式相同。

本實驗發(fā)現(xiàn)：除0.1mg·mL-1組外，各組HPDLCs存活率均低于空白組，且存活率隨著尼古丁質(zhì)量濃度的增加而降低；0.8mg·mL-1時細(xì)胞存活率降至空白組的77%。該趨勢與Alpar等[1]的研究結(jié)果相近，再次證明了尼古丁對HPDLCs的氧化毒性，故認(rèn)為建模成功。

ROS擁有未配對的活性電子，可奪取多數(shù)分子的電子來使自身穩(wěn)定，同時產(chǎn)生新的自由基，進(jìn)而啟動鏈?zhǔn)椒磻?yīng)造成細(xì)胞損傷。GSH被譽(yù)為“自由基清除器”，是細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)中的重要一環(huán)。GSH分子中的巰基（-SH）在提供1個電子后會優(yōu)先兩兩結(jié)合，形成性質(zhì)穩(wěn)定的氧化型GSH，從而中斷鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對細(xì)胞的損傷[6]。

Chang等[2]發(fā)現(xiàn)，尼古丁在降低HPDLCs存活率的同時會引起細(xì)胞內(nèi)GSH的大量消耗，而加入GSH前體分子OTZ（2-oxothiazolidine-4-carboxylic acid）后，不僅可使GSH濃度大幅度升高，細(xì)胞的存活率也顯著升高。這提示：在尼古丁對HPDLCs的氧化毒性中，GSH的消耗起著關(guān)鍵作用。

本實驗中，加入60μg·mL-1大蒜素后，HPDLCs存活率是尼古丁組的112%，接近對照組水平。與之對應(yīng)的是，細(xì)胞內(nèi)的GSH濃度也較尼古丁組在各時間點(diǎn)均有明顯提高，接近對照組水平。這表明：大蒜素可以有效地抑制尼古丁對HPDLCs的氧化毒性，其機(jī)制與阻止細(xì)胞內(nèi)GSH的消耗有關(guān)。

大蒜素是大蒜中提取出的活性成分，能顯著減少多種細(xì)胞在應(yīng)激后的ROS堆積和GSH消耗[7-9]，從而保護(hù)細(xì)胞。關(guān)于大蒜素降低ROS損傷的具體機(jī)制，筆者分析如下：大蒜素分子中含有1個S=O鍵，該鍵不穩(wěn)定，易被打開，導(dǎo)致大蒜素自身的高溫和堿不穩(wěn)定性；當(dāng)遇到ROS時，S=O鍵打開并提供2個自由電子，從而將2個分子ROS結(jié)合至自身；該反應(yīng)形成的產(chǎn)物性質(zhì)穩(wěn)定，阻斷了鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

此外，在0.8mg·mL-1尼古丁單獨(dú)作用的24 h內(nèi)，HPDLCs中GSH濃度呈現(xiàn)先降后升再降的趨勢，這與鄒朝霞等[10]的研究果一致。原因如下：起始階段由于ROS的氧化消耗，細(xì)胞內(nèi)GSH減少，然后細(xì)胞自身的抗氧化調(diào)節(jié)使得GSH增加，到24 h時因細(xì)胞的部分死亡導(dǎo)致GSH再次減少。

值得注意的是，與本實驗所提示的保護(hù)作用相反的是：有研究[11]顯示10μg·mL-1的大蒜素單獨(dú)作用即可造成多種成纖維細(xì)胞的死亡。筆者認(rèn)為：后者是由于大蒜素直接作用于細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路所導(dǎo)致；而在本實驗中，大蒜素優(yōu)先與尼古丁所產(chǎn)生的ROS結(jié)合，兩者間發(fā)生相互拮抗作用，沒有觸發(fā)凋亡信號通路，產(chǎn)生了保護(hù)效果。這一效果的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

從本實驗結(jié)果可以看出：常溫下性質(zhì)更穩(wěn)定、釋放更加持久的改良后的大蒜素可以運(yùn)用于口腔臨床中，為牙周病的治療提供輔助方案。

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（本文編輯 胡興戎）

Protective effect of allicin on human periodontal ligament cells with nicotine-induced oxidative damage

LI Bin-long,XIE Xiao-li,PENG Jie-ying,LUO Xiao-liang,JIN Lu-yuan.（Dept.of Oral Medicine,Xiangya Hospital of Central South University,Changsha410008,China）

ObjectiveTo explore the protective effect of allicin on nicotine-induced oxidative damage to human periodontal ligament cells（HPDLCs）.Methods1）Establish nicotine-induced oxidative damage model on HPDLCs.Use water-soluble tetrazolium（WST）colorimetric method to find out the nicotine concentration（X）that could inhibit HPDLCs’growth for the following experiments.2）HPDLCs of the fifth passage were divided into 5 groups:The control group,the nicotine group and the nicotine+allicin groups（the concentration of allicin was 15,30,and 60μg·mL-1respectively）.Different kinds of culture media were added.Similarly,use WST colorimetric method to choose the allicin concentration（Y）that could significantly improve the survival rate of HPDLCs.3）HPDLCs were divided into 3 groups:The control group,the nicotine group,the nicotine+allicin group and different media were added.The glutathion（GSH）concentrations in HPDLCs were determined in 1,4,8,12 and 24 h respectively.Results 0.8mg·mL-1nicotine could inhibit the HPDLCs survival rate significantly（77%of the control,P＜0.05）.But 60μg·mL-1allicin could prevent the inhibition effects evidently,improving the survival rate to 112%of that of the nicotine group（P＜0.05）and reaching the survival rate level of control group（P＞0.05）.The GSH concentrations of nicotine+allicin group were higher than that of the nicotine group always（P＜0.05）and by 82%at 8 h after culture,but had no difference with that of the control group（P＞0.05）.Conclusion60μg·mL-1allicin can protect the HPDLCs against oxidative damage induced by nicotine.

human periodontal ligament cells； nicotine； oxidative damage； allicin； glutathion

R 781

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.01.003

1000－1182（2011）01－0009-04

2010-02-12；

2010-04-28

湖南省科技廳基金資助項目（2010FJ3067）；中南大學(xué)理科發(fā)展基金資助項目（1773-206001081）

李斌龍（1983—），男，山西人，碩士

謝曉莉，Tel：13973164578