李卓然，黃 迪，盛 旦，趙 娟，葉 靜，陳 寧

（天津醫(yī)科大學(xué)1.臨床醫(yī)學(xué)七年制；2.病理生理學(xué)教研室，天津300070）

急性腎功能衰竭（acute renal failure,ARF）是由各種原因引起的腎泌尿功能在短時(shí)間內(nèi)急劇下降而出現(xiàn)的臨床綜合征。其中由腎缺血因素導(dǎo)致的ARF占50%。短期缺血時(shí)所出現(xiàn)的急性腎功能衰竭，通常為腎灌注減少導(dǎo)致腎小球?yàn)V過率降低所致。逆轉(zhuǎn)血流動(dòng)力學(xué)損害，會(huì)使腎功能迅速恢復(fù)。但若低灌注持續(xù)，可發(fā)生腎小管細(xì)胞損傷，從腎前性（功能性）轉(zhuǎn)向腎性(器質(zhì)性)急性腎功能衰竭[1-2]。因此及時(shí)恢復(fù)腎血流對(duì)患者的治療和預(yù)后都有重要意義。目前教學(xué)和科研中所用的急性腎衰模型多為汞中毒和缺血-再灌注損傷所致的器質(zhì)性急性腎衰[3]。本實(shí)驗(yàn)旨在復(fù)制出更貼近臨床實(shí)際病因，體現(xiàn)治療理論基礎(chǔ)的缺血性急性腎衰，為教學(xué)科研提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料和方法

1.1 主要藥物、試劑和儀器 20%烏拉坦溶液，常規(guī)手術(shù)器械，膀胱漏斗，輸液器，頸動(dòng)脈插管，自制計(jì)尿器，直徑0.70～0.90mm漁線，普通離心機(jī)（國(guó)產(chǎn)），i-STAT臨床血液分析系統(tǒng)（美國(guó)Abott公司出產(chǎn)），P模塊全自動(dòng)生化分析儀（瑞士Roche公司產(chǎn)品）。

1.2 動(dòng)物模型的制備 教學(xué)實(shí)驗(yàn)用健康新西蘭白兔8只（由天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體重1.6～2.2kg，雌雄不拘，雌者不孕。耳緣靜脈注射20%烏拉坦全身麻醉，經(jīng)靜脈補(bǔ)充120～150ml生理鹽水以增加基礎(chǔ)尿量。輸液期間暴露膀胱并置入連接膠管的膀胱漏斗；分離雙側(cè)腎動(dòng)脈并穿線備用；頸總動(dòng)脈插管以備取血。停止輸液10min后，記正常15min尿量，取0.5mL動(dòng)脈血做血?dú)夥治?，并另取?.5mL以備肌酐及電解質(zhì)檢測(cè)。然后將腎動(dòng)脈與長(zhǎng)0.80cm、直徑為0.90mm的漁線一并結(jié)扎，隨即取出漁線，造成腎動(dòng)脈狹窄、腎血流減少的病理狀態(tài)。缺血5min后開始收集尿液，并于15min后記錄尿量，同時(shí)再次取血檢測(cè)上述指標(biāo)。缺血20min后剪斷結(jié)扎線恢復(fù)腎動(dòng)脈血流，隨后每15min記錄所收集的尿量1次并于恢復(fù)血流后30、60min時(shí)各取血1次。除腎動(dòng)脈結(jié)扎前、結(jié)扎后20min及恢復(fù)腎動(dòng)脈血流60min時(shí)所取供血?dú)夥治龅难獦恿⒓礄z測(cè)外，其余所取血液標(biāo)本離心后取血清保存于-20℃?zhèn)錂z。分別在正常、缺血20min、恢復(fù)血流1h和5h時(shí)取左腎，做病理檢查。

1.3 腎功能測(cè)定 用最小刻度為0.1mL的小量器收集尿液并記錄尿量。采用Roche全自動(dòng)生化分析儀及試劑，用P模塊、酶法測(cè)定血清肌酐。采用電極法測(cè)定鈉、鉀、氯。使用i-STAT臨床血液分析系統(tǒng)做動(dòng)脈血?dú)夥治觥?/p>

1.4 組織病理切片 將所取一側(cè)腎臟于10%中性甲醛中固定后，石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察各時(shí)段兔腎組織病理形態(tài)學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 尿量 比較實(shí)驗(yàn)各階段收集的15min尿量，雙側(cè)腎動(dòng)脈結(jié)扎后（after ligation,AL）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的尿量明顯少于結(jié)扎前(before ligation，BL)，恢復(fù)腎血流后（after resuming perfusion,ARP）尿量回升，15～30min期間的尿量增多達(dá)到峰值，之后回降到接近正常水平。見圖1。

2.2 血清肌酐（Cr）水平 與結(jié)扎前比較，腎動(dòng)脈不全結(jié)扎后動(dòng)物血清Cr水平顯著升高(P<0.01)，恢復(fù)血流后30min其水平已有顯著下降（P<0.05），至恢復(fù)血流60min時(shí)下降更甚（P<0.01），與結(jié)扎前相比已無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表1。

表1 家兔血清肌酐及電解質(zhì)的變化（±s）Tab 1 Changes of serum creatinine and electrolytes in rabbits

表1 家兔血清肌酐及電解質(zhì)的變化（±s）Tab 1 Changes of serum creatinine and electrolytes in rabbits

**P＜0.01vs BL；△P＜0.05，△△P＜0.01vs 20minAL

時(shí)間BL 20min AL 30min ARP 60min ARP Cr(μmol/L) n=875.56±8.0590.64±10.28** 82.88±12.53△78.48±11.22△△Na+（mmol/L）n=5146.28±4.16147.30±5.57134.08±19.81142.90±3.91K+(mmol/L) n=52.82±0.312.95±0.392.68±0.542.84±0.17Cl-(mmol/L) n=5104.32±3.02106.74±2.6797.18±16.38104.20±4.14

2.3 血清鈉、鉀、氯檢測(cè) 經(jīng)重復(fù)測(cè)量分析各時(shí)段鈉、鉀、氯水平雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但可見在腎動(dòng)脈不全結(jié)扎20min后，血清鉀水平呈升高趨勢(shì)；隨腎血流恢復(fù)，血清鈉、鉀、氯水平均呈下降變化，惟血鉀水平下降后又有所回升。見表1。

2.4 動(dòng)脈血?dú)夥治?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎動(dòng)脈結(jié)扎后20min時(shí)，動(dòng)脈血pH值及碳酸氫鹽（HCO3-）值均較結(jié)扎前下降，而剩余堿（BE）負(fù)值增大。血流恢復(fù)60min后pH及HCO3-下降更加明顯；BE負(fù)值繼續(xù)增大。見表2。

表2 家兔動(dòng)脈血?dú)庵笜?biāo)變化（n=4，±s）Tab 2 Changes of blood gas in rabbits（n=4，±s）

表2 家兔動(dòng)脈血?dú)庵笜?biāo)變化（n=4，±s）Tab 2 Changes of blood gas in rabbits（n=4，±s）

*P<0.05,**P<0.01vs BL；△P<0.05,△△P<0.01vs 20min AL

時(shí)間BL 20min AL 60min ARP pH 7.42±0.077.40±0.067.35±0.05*△PaCO2(mmHg) 31.56±4.2430.83±4.3630.4±4.66HCO3-(mmol/L) 20.04±3.3419.51±4.91* 17.05±4.22**△BE(mmol/L) -3.86±5.05-5.29±5.74* -8.75±4.92*△△

2.5 兔腎病理形態(tài)學(xué)檢查 將各時(shí)段兔腎組織于光鏡下觀察，缺血20min及恢復(fù)血流1h和5h兔腎腎被膜光滑，皮髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清楚，腎小球體積未見縮小或肥大，數(shù)目未見減少，各腎小管上皮細(xì)胞未見變性、壞死或脫落，管腔中未見管型及結(jié)石，腎間質(zhì)未見炎細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生，腎盂上皮完整，與未結(jié)扎的正常兔腎相比無著變。

3 討論

腎臟是機(jī)體最重要的排泄器官，急性腎功能衰竭是臨床常見的危重病癥。為更加明確其發(fā)病機(jī)制和探索新的治療方法，在科研和教學(xué)中很多學(xué)者從不同角度、采取多種不同的方法制作急性腎功能衰竭的動(dòng)物模型。目前采用的主要有以下2種方法：(1)肌內(nèi)或皮下注射HgCl2復(fù)制急性中毒性腎功能衰竭動(dòng)物模型[4-5]。(2)用動(dòng)脈夾夾閉腎蒂，缺血一定時(shí)間后恢復(fù)血液灌流，造成缺血-再灌注損傷，進(jìn)而形成急性腎衰動(dòng)物模型[6-7]。但相對(duì)于低灌注來說，毒物并不是造成ARF的主要原因；而后一種模型已超過腎缺血本身對(duì)腎功能影響及其所導(dǎo)致的缺血性急性腎衰的范疇。此外雖可見通過腎動(dòng)脈或靜脈注射內(nèi)毒素或去甲腎上腺素等藥物造成急性腎衰動(dòng)物模型的報(bào)道，但是也存在難以預(yù)料實(shí)驗(yàn)個(gè)體反應(yīng)的問題[8-9]。能夠在實(shí)驗(yàn)過程中控制雙腎缺血程度的腎前性急性腎衰模型，目前尚鮮有報(bào)道。

經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[10-11]和大量預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終選定以直徑0.90mm的漁線進(jìn)行雙側(cè)腎動(dòng)脈不全結(jié)扎，并在腎缺血20min后恢復(fù)血流的方法制作急性功能性腎衰模型。結(jié)果顯示雖然動(dòng)物個(gè)體之間尿量差異較大，但總體看來，在雙側(cè)腎動(dòng)脈不全結(jié)扎人為造成腎動(dòng)脈狹窄狀態(tài)，導(dǎo)致腎灌注量減少后，由于腎小球?yàn)V過率下降，出現(xiàn)了尿量減少。而同期的肌酐水平顯著升高則顯示了腎小球?yàn)V過功能受損造成了代謝產(chǎn)物的蓄積。此外，腎排泄功能下降還導(dǎo)致了代謝性酸中毒相應(yīng)的血?dú)庾兓脱邂浀纳仙Ｈ毖?0min后恢復(fù)腎血流，尿量隨之逐步增多，至恢復(fù)腎血流30min時(shí)達(dá)到高峰，然后趨向正常。結(jié)合血清肌酐、電解質(zhì)檢測(cè)及病理檢查，分析這種變化可能與前期腎排泄功能下降導(dǎo)致代謝產(chǎn)物潴留，隨著腎濾過功能的恢復(fù)，代謝產(chǎn)物排出增多而引起的滲透性利尿有關(guān)[12]。至于恢復(fù)血流60min時(shí)血清鉀水平又呈上升趨勢(shì)，則不能排除尚存的代謝性酸中毒的影響。綜合上述腎缺血后出現(xiàn)多重腎功能障礙表現(xiàn)、及時(shí)恢復(fù)血流后腎功能很快就得以改善恢復(fù)，以及病理切片沒有發(fā)現(xiàn)腎單位結(jié)構(gòu)發(fā)生著變的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示所復(fù)制出的動(dòng)物模型具有功能性急性腎功能衰竭的特征。

為提高模型成功率，通過大量預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸索出以下經(jīng)驗(yàn)：(1)為保證在短時(shí)間內(nèi)收集到肉眼可見的基礎(chǔ)尿量，對(duì)于缺水的實(shí)驗(yàn)用兔，最好于實(shí)驗(yàn)前經(jīng)靜脈補(bǔ)充適量生理鹽水。(2)缺血時(shí)間以20min為宜，時(shí)間過短不足以造成顯著的病理生理變化，時(shí)間過長(zhǎng)，則可造成器質(zhì)性損傷（如缺血30min后再恢復(fù)血流，病理上表現(xiàn)為光鏡下部分腎小管上皮細(xì)胞有空泡變性及間質(zhì)灶性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)），同時(shí)還存在再灌注損傷的可能。(3)根據(jù)家兔腎動(dòng)脈粗細(xì)，可對(duì)結(jié)扎所用漁線的型號(hào)進(jìn)行必要的調(diào)整。

綜上所述，以雙側(cè)腎動(dòng)脈不全結(jié)扎方法復(fù)制出的急性腎功能衰竭動(dòng)物模型，體現(xiàn)了腎缺血因素在急性腎功能衰竭發(fā)生及治療方面的作用，使學(xué)生在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)習(xí)階段即可體驗(yàn)到與臨床實(shí)際的密切聯(lián)系。該方法要求的實(shí)驗(yàn)工具和操作技術(shù)簡(jiǎn)易，內(nèi)容豐富，可為開展腎前性（功能性）急性腎衰有關(guān)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)和臨床科研提供實(shí)驗(yàn)參考。

（本研究得到天津醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室王永明老師、天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院檢驗(yàn)科郭蓓老師的大力支持，在此一并致謝）

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